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【概述】

食品貿(mào)易的長足發(fā)展使各種果蔬得以全年供應(yīng)。不過，這也對努力確保食品供應(yīng)鏈安全的食品安全監(jiān)管機(jī)構(gòu)提出了全新的挑戰(zhàn)，特別是各地可能使用的數(shù)百種農(nóng)藥的安全問題。為此，歐盟制定了為嚴(yán)格的農(nóng)殘法規(guī)：2008年，歐盟頒布EC No. 396/20051法規(guī)，將尚未設(shè)置實(shí)質(zhì)性大殘留*（MRL）的所有農(nóng)藥/商品組合的默認(rèn)MRL設(shè)置為10μg/Kg；繼此，2009年，農(nóng)藥安全審查EU 91/414/EEC2指令使約250種農(nóng)藥得以批準(zhǔn)，并將所有其他農(nóng)藥的容許殘留量設(shè)置為默認(rèn)限值（10μg/Kg）；近，新版“食品飼料中農(nóng)殘分析的質(zhì)量控制和方法確認(rèn)的指導(dǎo)文件SANTE/11945/2015”于2016年年初正式實(shí)施3。該指導(dǎo)文件介紹了方法驗(yàn)證和分析質(zhì)量控制（AQC）的要求，以支持在農(nóng)殘*控制框架內(nèi)報(bào)告并用于大殘留*（MRLs）合規(guī)性檢查、執(zhí)法行動或消費(fèi)者暴露評估的數(shù)據(jù)的有效性。該文件預(yù)期供歐洲*控制實(shí)驗(yàn)室使用，而實(shí)際上被廣泛用于世界各地的農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室。嚴(yán)格的要求的實(shí)施為致力于提供具有成本競爭優(yōu)勢的服務(wù)的檢測實(shí)驗(yàn)室提出了巨大挑戰(zhàn)。

 

農(nóng)殘測試通常要求使用結(jié)合三重四極桿質(zhì)譜儀的液相和氣相色譜技術(shù)進(jìn)行檢測。這些分析技術(shù)必須符合選擇性監(jiān)測的化合物范圍和靈敏度的要求，但是于檢測那些在數(shù)據(jù)采集時進(jìn)行測量的目標(biāo)農(nóng)藥，故需謹(jǐn)慎的方法優(yōu)化和管理，以確保所選離子監(jiān)測窗口可行。近年來，高分辨率Orbitrap質(zhì)譜儀憑借其附加逐步添加逐步成為MS/MS技術(shù)的替代技術(shù)。

使用高分辨率質(zhì)譜儀（HRMS）時，默認(rèn)采集模式為非靶向（全掃描）模式，便于管理和在單次進(jìn)樣中監(jiān)測無限數(shù)量的農(nóng)藥。此外，全掃描數(shù)據(jù)分析還提供對定性識別點(diǎn)的補(bǔ)充（如質(zhì)譜圖檢索）的訪問，使樣品的回顧性分析成為可能，以另行檢索在數(shù)據(jù)采集時未予考慮的新興農(nóng)藥或其他雜質(zhì)。

 

在本研究中，按照 SANTE/11945/2015指導(dǎo)文件，在全掃描模式下，針對果蔬中 GC 可測農(nóng)藥的常規(guī)分析，對Thermo ScientificTM Exactive GC OrbitrapTM質(zhì)譜儀的定量特性進(jìn)行了評估。Exactive GC-MS系統(tǒng)提供高達(dá) 60,000 （m/z 200 時 FWHM） 的常規(guī)高質(zhì)量分辨率和適合 GC 峰的掃描速度，促進(jìn)復(fù)雜基質(zhì)成分中痕量化合物的檢測。

【實(shí)驗(yàn)/設(shè)備條件】

表1. GC條件。

表2.質(zhì)譜儀條件

【實(shí)驗(yàn)/操作方法】

從當(dāng)?shù)爻匈徣胛骷t柿、韭蔥和橙子，按照檸檬酸鹽緩沖體系的QuEChERS方法進(jìn)行前處理，將10 mL乙腈加入10 g均質(zhì)樣品中，振蕩4分鐘。加入鹽混合物，將離心管振蕩4分鐘，再以3700 rpm的速度離心5分鐘。將上清液（5 mL）轉(zhuǎn)移到內(nèi)含硫酸鎂和125 mg PSA的15 mL PTFE離心管中。在渦旋振蕩器中振蕩提取物，如上進(jìn)行離心。終的乙腈提取物（1g/mL）用作空白基質(zhì)。制備校準(zhǔn)液系列時，取100μl乙腈空白基質(zhì)在氮?dú)饬飨赂稍?。在含有適當(dāng)濃度農(nóng)藥的100μl乙酸乙酯中對樣品進(jìn)行復(fù)溶。

在西紅柿、韭蔥和橙子體系中，配制51種農(nóng)藥的三個校準(zhǔn)液系列，濃度為0.5、1、2、5、10、20、50、100、200

和500μg/Kg。這51種農(nóng)藥涵蓋了范圍廣泛的化學(xué)農(nóng)藥類別，使用這三種基質(zhì)共產(chǎn)生153種農(nóng)藥/基質(zhì)組合。評估化合物線性時，先分析與校準(zhǔn)液系列匹配的基質(zhì)，再對每種基質(zhì)的10μg/Kg樣品進(jìn)行10次重復(fù)進(jìn)樣。評估一段時間內(nèi)的可重復(fù)性，再將同一樣品瓶中10μg/Kg的西紅柿標(biāo)樣進(jìn)樣100次。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果/結(jié)論】

本研究旨在根據(jù)SANTE指令要求評估Exactive GC系統(tǒng)在三種不同樣品基質(zhì)中對農(nóng)藥進(jìn)行常規(guī)分析的性能。所選樣品

（西紅柿、韭蔥和橙子）呈現(xiàn)了常規(guī)測試中常見的簡單和復(fù)雜基質(zhì)。為加以說明，圖1顯示了不同樣品復(fù)雜度的總離子色譜圖（帶固定Y軸）。韭蔥基質(zhì)顯然是復(fù)雜的基質(zhì)，需以高質(zhì)量分辨率將目標(biāo)分析物從化學(xué)噪聲背景中提取出來。

 

針對常規(guī)農(nóng)藥篩查，HRMS處理軟件需快速、準(zhǔn)確且可根據(jù)不同的需求進(jìn)行定制。TraceFinder可滿足所有這些要求，并在5分鐘內(nèi)處理各批校準(zhǔn)標(biāo)樣和10次復(fù)制樣品。在TraceFinder中，結(jié)果以表格格式呈現(xiàn)給用戶，并使用數(shù)據(jù)標(biāo)記來快速識別陽性農(nóng)藥和所滿足的標(biāo)準(zhǔn)。靈活的報(bào)告選項(xiàng)意味著數(shù)據(jù)可導(dǎo)出到其他軟件或直接從TraceFinder進(jìn)行結(jié)果的報(bào)告。

 

根據(jù)指導(dǎo)要求進(jìn)行確認(rèn)

該分析的一個目的是確定全部三種基質(zhì)中所有農(nóng)藥的檢出限（LOD）、確認(rèn)限（LOI）、線性范圍和峰面積重復(fù)性。盡管SANTE指導(dǎo)文件中并未討論LOD，但由于依據(jù)定量離子得到的的檢測限用于形成終的校準(zhǔn)系列，并終用于確定樣品中檢測到農(nóng)藥的濃度，因此掌握定量離子的檢出限十分有益。通過評估基質(zhì)匹配校準(zhǔn)系列和每種基質(zhì)10μg/Kg水平的農(nóng)藥的重復(fù)進(jìn)樣評估LOD。LOD定義為農(nóng)藥主要定量離子的提取離子色譜圖（XIC）中存在S/N（峰到峰）＞3的峰。LOI的確定應(yīng)遵SANTE/11945/2015指導(dǎo)文件。為進(jìn)行正確確認(rèn)，應(yīng)滿足以下要求：

圖1. Y軸固定于4.0 e9的西紅柿、韭蔥和橙子提取物的全掃描總離子色譜圖（TIC），顯示本研究中所用樣品基質(zhì)的復(fù)雜性。

(i)每種農(nóng)藥檢出兩種離子且質(zhì)量度< 5 ppm，峰S/N > 3

(ii)保留時間容差±0.1 min（與同一序列的標(biāo)準(zhǔn)品相比）

(iii)離子比率在同一序列標(biāo)準(zhǔn)品的平均離子比率的±30%以內(nèi)。

(iv)可選項(xiàng)：為使鑒定達(dá)到更高的置信度，可使用其它標(biāo)準(zhǔn)，如全掃描質(zhì)譜、同位素模式匹配及其他碎片離子。

 

遵循監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)（LOI）對所有濃度小于等于5μg/Kg（表3-5）的基質(zhì)中除韭蔥中百菌清以外的所有農(nóng)藥進(jìn)行鑒定。百菌清因與韭蔥基質(zhì)中的硫化合物相互作用而發(fā)生損失。5153種農(nóng)藥/基質(zhì)組合（79%）中的多數(shù)具有≤  2μg/Kg的確認(rèn)限。圖2為計(jì)算出的檢出限匯總，圖中顯示93%的農(nóng)藥/基質(zhì)組合的檢出限≤ 1μg/Kg。多個鑒定點(diǎn)和遠(yuǎn)低于MRL的檢出限增加了鑒定的置信度并降低了假陰性和假陽性的結(jié)果。將電子轟擊電離（EI）與全掃描采集相結(jié)合能夠用多定性

離子鑒定農(nóng)藥。

圖2.農(nóng)藥/基質(zhì)組合的檢出限（LOD）和確認(rèn)限（LOI）

Exactive GC系統(tǒng)生成標(biāo)準(zhǔn)的EI質(zhì)譜圖，重現(xiàn)性高，易于庫檢索（低分辨或高分辨率MS數(shù)據(jù)庫），讓基于質(zhì)譜圖檢索進(jìn)行的農(nóng)藥檢測和鑒定更加方便。由于Orbitrap分析儀的質(zhì)量度足夠高，化學(xué)式可輕松的與碎片離子質(zhì)量數(shù)吻合，故可快速添加此結(jié)果至化合物數(shù)據(jù)庫中。

定量可靠

在0.5-500μg/Kg的濃度范圍內(nèi)，使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量線性評估。在所有情況下，在三種基質(zhì)中，從檢出限到500μg/Kg，每種農(nóng)藥的相關(guān)系數(shù)（R2）均> 0.99。圖3為TraceFinder瀏覽器顯示的撲滅津?qū)嵗??；蚴芊治鑫镂降挠绊?，苯銹啶的濃度線性至200μg/Kg，屬于個別例外。定量取決于多項(xiàng)因素，其中一項(xiàng)因素為采集速度，采集速度應(yīng)足夠快速，以能在色譜峰中提供至少12個點(diǎn)。Exactive GC系統(tǒng)的分辨率達(dá)60,000，掃描速度約7 Hz。圖4為在6秒峰上有38個點(diǎn)的乙酯殺螨醇峰。

圖3.顯示鑒定結(jié)果呈陽性的農(nóng)藥、提取離子色譜圖及校準(zhǔn)圖的TraceFinder瀏覽器（以撲滅津?yàn)槔?。在校?zhǔn)范圍內(nèi)和10μg/kg重復(fù)樣品樣中sub-ppm的撲滅津的質(zhì)量度。當(dāng)超出規(guī)定時提示并標(biāo)記鑒定標(biāo)準(zhǔn)信息。

表3.韭蔥中農(nóng)藥的方法性能總結(jié)。*韭蔥中降解的百菌清。

 

圖4.在分辨率為60,000（m/z 200時FWHM）的條件下，從添加濃度為10μg/Kg的韭蔥樣品中獲得的乙酯殺螨醇（m/z 251.0025±5 ppm質(zhì)量窗口）的提取離子色譜圖。結(jié)果顯示~38次掃描/峰（峰寬6s）。每次掃描所達(dá)到的度低于1 ppm（每第三次掃描標(biāo)記一次）。峰上的平均RMS質(zhì)量差異為0.6 PPM。

圖5顯示在所有三種基質(zhì)中重復(fù)進(jìn)樣10次（濃度為10μg/Kg）的結(jié)果。所檢測到的農(nóng)藥的%RSD小于10%，遠(yuǎn)低于SANTE指導(dǎo)文件所規(guī)定閾值（20%），表明在分辨率為60k條件下以全掃描模式所運(yùn)行的Exactive GC系統(tǒng)達(dá)到了可靠分析農(nóng)藥所需的選擇性和靈敏度，遠(yuǎn)低于各自的MRL。

圖5.所研究的三種基質(zhì)中，每種農(nóng)藥在濃度為10μg/Kg（n=10）條件下的峰面積重復(fù)性（%RSD）。圖中還顯示SANTE指導(dǎo)文件的閾值為20%。

表4.橙子中農(nóng)藥的方法性能結(jié)果總結(jié)。* LOD-200μg/Kg

可靠的質(zhì)量度

當(dāng)檢測復(fù)雜樣品基質(zhì)中的低濃度農(nóng)藥時，獲取可靠的質(zhì)量數(shù)測定至關(guān)重要。在數(shù)據(jù)處理過程中，較低的質(zhì)量誤差可在使用窄質(zhì)量提取窗時確保高選擇性并有助于確保陽性檢測的可靠性。通過辨別基質(zhì)干擾和目標(biāo)分析物離子的高質(zhì)量分辨力，使用Exactive GC系統(tǒng)時可達(dá)到低質(zhì)量誤差。當(dāng)分辨率不足時，兩個離子質(zhì)譜圖重疊，造成目標(biāo)化合物的讀出質(zhì)量數(shù)產(chǎn)生偏離。圖6為在分辨率分別為15K、30K、60K條件下，對濃度為10μg/Kg的韭蔥基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品所做的分析。

質(zhì)譜圖顯示二甲嘧菌胺的定量離子和產(chǎn)生干擾的質(zhì)量相近的基質(zhì)離子。在 15 K 和 30 K 條件下，未能分離二甲嘧菌胺離子，致使質(zhì)量度較差，分別為 10.1 ppm和 6.3 ppm。但在 60 K 條件下，離子被*分類，達(dá)到預(yù)期質(zhì)量度（小于1 ppm）。如達(dá)不到此質(zhì)量分辨率，則此農(nóng)藥將達(dá)不到 SANTE 鑒定標(biāo)準(zhǔn)（＜ 5 ppm）且會出現(xiàn)假陰性結(jié)果（報(bào)告為“未檢測到”）。這支持了先前的報(bào)告，即在某些情況下，為確保高選擇性，分辨率需達(dá)到 60 K（200 m/z）。6

 

圖6.在15K、30K和60K的分辨率條件下，分辨率對添加濃度為10μg/Kg的韭蔥樣品中二甲嘧菌胺診斷離子質(zhì)量度的影響。在15K和30K條件下，二甲嘧菌胺離子未從干擾基質(zhì)離子中分離出來，致使質(zhì)量度分配較差。

表5.西紅柿中農(nóng)藥的方法性能結(jié)果總結(jié)。

 

對51種農(nóng)藥的LOI處進(jìn)行質(zhì)量度評估，評估結(jié)果如圖7所示。所有分析物的質(zhì)量誤差值均未超過1.2 ppm，遠(yuǎn)低于指導(dǎo)文件的限值（5 ppm），在的選擇性檢測中，提供高置信度。

 

在農(nóng)藥分析中，儀器應(yīng)能夠在整個可能遇到的分析物濃度范圍內(nèi)保持質(zhì)量度，這點(diǎn)也非常重要。如因檢測器飽和而造成高濃度農(nóng)藥超標(biāo)，則無法接受。在Exactive GC系統(tǒng)中，通過使用自動增益控制（AGC）來控制離子的進(jìn)入數(shù)量，從而保護(hù)Orbitrap分析儀免于飽和。這確保了無論濃度高低，均能保持良好的質(zhì)量度。如圖8所示，當(dāng)韭蔥基質(zhì)中的濃度范圍為0.5～500μg/Kg時，四種農(nóng)藥的質(zhì)量度始終< 1 ppm。

 圖7.三種基質(zhì)中每種農(nóng)藥在LOI處的質(zhì)量差異測定值

圖8.韭蔥中四種農(nóng)藥在0.5-500μg/mL的濃度范圍內(nèi)的質(zhì)量度測定值。質(zhì)量度保持在

1 ppm以下。

 

實(shí)際性能

在高通量常規(guī)農(nóng)藥分析實(shí)驗(yàn)室，質(zhì)譜儀始終處于持續(xù)運(yùn)行的狀態(tài)，因此儀器在相對較長時間內(nèi)保持同等性能水平非常重要。為評估Exactive GC系統(tǒng)在較長時間內(nèi)的性能，在同一樣品瓶中對濃度為10μg/Kg的西紅柿提取物重復(fù)進(jìn)樣100次。開始分析前，安裝一個新的進(jìn)樣口襯管，調(diào)諧離子源并校準(zhǔn)MS。

在66小時的連續(xù)運(yùn)行中未進(jìn)行其他干預(yù)。結(jié)果表明，從進(jìn)樣器到MS，該系統(tǒng)性能持續(xù)穩(wěn)定。圖9顯示經(jīng)過100次進(jìn)樣，濃度為10μg/Kg的西紅柿中的六氯苯、乙烯菌核利和氟樂靈的峰面積響應(yīng)，其中RSD%分別為5.3%、4.6%和3.8%。此外，在未做進(jìn)一步質(zhì)量校準(zhǔn)的情況下，分析持續(xù)時間內(nèi)的質(zhì)量度穩(wěn)定性< 1.2 ppm（99% ≤1 ppm）（圖10）。

圖9.添加濃度為10μg/Kg的西紅柿提取物的100次重復(fù)進(jìn)樣。結(jié)果表明，在66小時的連續(xù)運(yùn)行中均保持良好的靈敏度。

圖10.濃度為10μg/Kg的西紅柿提取物中六氯苯、乙烯菌核利和氟樂靈100次進(jìn)樣的質(zhì)量度(ppm)。在使用同一襯管且不進(jìn)一步校正質(zhì)譜儀或調(diào)諧離子源時獲得的數(shù)據(jù)。

 

結(jié)論

本研究結(jié)果表明，與TraceFinder軟件配用的Thermo ScientificExactive GC Orbitrap高分辨率質(zhì)譜儀是一個高性能的分析系統(tǒng)，可在*遵循SANTE指導(dǎo)文件的前提下，針對果蔬中的常規(guī)農(nóng)藥分析，提供穩(wěn)定的、高靈敏度的分析定量性能。

—經(jīng)檢測，99.3%的農(nóng)藥/基質(zhì)組合可在低于MRL下檢測到，線性良好且符合所要求的性能標(biāo)準(zhǔn)。重要的是，在全掃描采集模式下，使用化合物數(shù)據(jù)庫對目標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理增加了分析物的范圍。

 

—當(dāng)在復(fù)雜樣品基質(zhì)中篩選農(nóng)藥時，以60,000 FWHM的分辨率進(jìn)行采集顯著降低了基質(zhì)干擾并提高了結(jié)果的置信度。針對較寬濃度范圍內(nèi)的所有化合物均達(dá)到sub-ppm的一致質(zhì)量度，確保了化合物在不同濃度水平下檢測的置信度。

 

—西紅柿基質(zhì)以10μg/Kg的濃度重復(fù)進(jìn)樣表明系統(tǒng)能在較長時間內(nèi)保持性能一致性，符合常規(guī)檢測實(shí)驗(yàn)室的要求。

【儀器/耗材清單】

儀器

ExactiveTMGCOrbitrapTM質(zhì)譜儀

Thermo ScientificTMTriPlusTMRSHTM自動進(jìn)樣器

Thermo ScientificTMTRACETM1310氣相色譜儀