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構建穩(wěn)定細胞株是生物制藥領域CMC流程中的核心步驟，通過精心策劃的實驗設計篩選出高效且穩(wěn)定表達目標蛋白的細胞株，從而為后續(xù)的生物制品的產量和質量奠定基礎。
在構建穩(wěn)定細胞株過程中，以下的關鍵環(huán)節(jié)需嚴格遵循以確保高效與穩(wěn)定：
1.載體策略與設計：在載體設計階段，需精心選擇啟動子、增強子等調控元件，以精確控制目的基因的表達水平。
2. 轉染方法與優(yōu)化：根據(jù)目標細胞類型及實驗需求，選擇合適的轉染方法，如電轉、脂質體介導、病毒介導等。
3.高通量篩選與克隆鑒定：利用高通量篩選技術和先進的檢測方法，如單細胞打印機，對轉染后的細胞進行快速篩選，挑選出表達水平高且穩(wěn)定的細胞克隆。
4.表達穩(wěn)定性監(jiān)測：在細胞株構建完成后，需定期檢測目標基因的表達情況，包括表達水平、時空分布等。通過長期跟蹤監(jiān)測，確保細胞株的遺傳穩(wěn)定性和表達穩(wěn)定性，以滿足后續(xù)實驗與應用的需求。
單克隆篩選是細胞系開發(fā)中的關鍵步驟，旨在從混合細胞群體中分離出單個細胞，并使其增殖形成遺傳背景均一的細胞克隆。以下是一些常見的單克隆篩選方法：有限稀釋法，半固體培養(yǎng)基挑選法，以及流式細胞術挑選法等。
有限稀釋法和流式熒光激活細胞分選（FACS）很常見，但在效率、選擇控制和細胞活力等方面都不理想。有限稀釋法雖然經(jīng)濟，可能比FACS分選對細胞造成損傷小，但耗時耗力，可能還會有些人為因素的影響。
流式分選雖然對單細胞有良好控制且通量高，但分選時產生的高剪切力和持續(xù)靜電，會對敏感或部分受損細胞（如電轉）的存活率/克隆效率有很大不良影響。
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