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2018-12-18 閱讀(2642)
Western Blot實驗又稱蛋白質(zhì)印跡法、免疫印跡試驗。Western Blot是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法。Western Blot原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。
在Western Blot實驗中通常需要注意以下幾個問題:
1. 免疫印跡雜交的敏感與檢測系統(tǒng)有關(guān).因此,凝膠電泳時的蛋白上樣量應(yīng)該保證被檢測抗原量不于太低,如果過低應(yīng)該重新純化和濃縮使用,或者建議做一次梯度稀釋,上樣電泳后,直接考馬斯亮藍染色選擇較好上樣量,純化和濃縮的蛋白質(zhì)樣品必須注意鹽的濃度過高,可平衡一下鹽的濃度,如,透析。
2. 形成凝膠的試劑要有足夠的純度,激活劑的濃度適當(dāng),不僅可以決定凝膠聚合的速度,也將影響凝膠的質(zhì)量,聚膠時的溫度也將影響凝膠聚合的速度.因此,建議要根據(jù)不同溫度下適量增減激活劑的用量以保證分離膠從加入激活劑起開始出現(xiàn)凝膠凝聚的時間為15-20分鐘,對于濃縮膠較好聚合時間為8-10分鐘開始可見聚合.灌完分離膠加水封閉分離膠與外界氧氣的結(jié)合。
3. 未聚合的丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性,操作時應(yīng)該戴手套防護.梳子插入濃縮膠時,應(yīng)確保沒有氣泡,可將梳子稍微傾斜插入以減少氣泡的產(chǎn)生,梳子拔出來時應(yīng)該小心,不要破壞加樣孔,如有加樣孔上的凝膠歪斜可用枕頭插入加樣孔中糾正但要避免枕頭刺入膠內(nèi)。
4. 電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液沖洗清除黏附在凝膠底部的氣和未聚合的丙烯酰胺,同時建議低電壓短時間的預(yù)電泳,清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì),疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通(恒壓10-20V,20-30min)。
5. 加樣前樣品應(yīng)先離心,尤其是長時間放置的樣品,以減少蛋白質(zhì)帶的拖尾現(xiàn)象。
6. 為避免邊緣效應(yīng),可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液。
7. 樣品緩沖液中煮沸的樣品可在-20℃存放數(shù),,但是反復(fù)凍融會使蛋白質(zhì)降解。
8. 為減少蛋白質(zhì)條帶的擴散,上樣后應(yīng)盡快進行電泳,電泳結(jié)束后也應(yīng)直接或者轉(zhuǎn)印。
9. 上樣時,小心不要使樣品溢出而污染相臨加樣孔。
10. 取出凝膠后應(yīng)注意分清上下,可用刀片切去凝膠的一角作為標(biāo)記(如左上角)轉(zhuǎn)膜時也應(yīng)用同樣的方法對NC膜做上標(biāo)記(如左上角)以分清正反面和上下關(guān)系。
11. 轉(zhuǎn)膜時應(yīng)依次放好NC膜與凝膠所對應(yīng)的電極,即凝膠對應(yīng)負極,NC膜對應(yīng)正極。
