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2-8℃避光

1.開蓋前請離心。
2.開蓋后組份按要求條件保存。
3.拆封后請盡快使用完！

1年

1.流式細(xì)胞儀
2.激光共聚焦
3.熒光顯微鏡

1.懸浮細(xì)胞
2.貼壁細(xì)胞

1.方便：可用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測；
2.快速：1小時內(nèi)即可完成實驗；
3.準(zhǔn)確：能準(zhǔn)確區(qū)分活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，并計數(shù)各群細(xì)胞的比例。

1.流式細(xì)胞儀
2.激光共聚焦
3.熒光顯微鏡

1.流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡或激光共聚焦
2.離心機
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒

1.PBS 緩沖液（pH7.4，實驗室常用的10mM磷酸緩沖鹽溶液（1X））
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）

1.離心管
2.吸頭
3.一次性手套
4.鋁箔

1.螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體損失導(dǎo)致試劑量不夠用。
2.細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞。離心力在不損失細(xì)胞的前提下盡可能小，重懸細(xì)胞是動作要輕柔，避免多次反復(fù)的激烈吹打。不用渦旋振蕩器。
3.Annexin V-FITC（等）和Propidium iodide（等）是光敏物質(zhì)，在操作時請注意避光，盡量減少它們暴露在光下的時間。有必要時可以使用帶蓋子的冰盒或鋁箔紙避光。標(biāo)記后將細(xì)胞保持在避光環(huán)境中。移液過程中短暫暴露在光線下（<30秒）是可以接受的。
4.由于細(xì)胞凋亡是一個快速和動態(tài)的過程，因此在染色后立即進(jìn)行分析。
5.使用Annexin V-FITC（等） 試劑盒檢測凋亡需要針對活細(xì)胞。不要固定細(xì)胞，固定操作會對結(jié)果產(chǎn)生干擾。

樣品染色：
1、 離心收集懸浮細(xì)胞。離心機300-500g力，2-8°C，離心時間5分鐘，棄培養(yǎng)基。
2、 用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次。（300g-400g，2-8°C，離心時間5分鐘收集細(xì)胞）。
3、 用100 μl 1X Annexin V結(jié)合液懸浮細(xì)胞，濃度大約為1-5 X 106 cells/ml。
4、 在細(xì)胞懸浮液中加入5 μl Annexin V-APC染色液，輕輕混勻后于2-8°C避光條件下孵育5-10分鐘。
5、 加入5-10 μl Nuclear Green 染色液后輕輕混勻于2-8°C避光條件下孵育1-3分鐘。
6、 加入400 μl PBS或1X Annexin V結(jié)合液，輕輕混勻。
7、 立即用流式細(xì)胞儀檢測。

流式細(xì)胞儀分析：
經(jīng)處理過的細(xì)胞此時可以在流式細(xì)胞儀上分析。
按照常規(guī)的流式凋亡檢測的操作即可。
Annexin V-APC的熒光激發(fā)波長652 m，發(fā)射波長670 m；Nuclear Green 熒光激發(fā)波長502 m，發(fā)射波長在526 m。

上機檢測前，須用待測細(xì)胞制備質(zhì)控樣本來設(shè)定流式細(xì)胞儀的熒光補償和設(shè)置十字門的范圍：
（I） 未轉(zhuǎn)染GFP等標(biāo)記的細(xì)胞
① 空白管：陰性對照組細(xì)胞，沒有染色的細(xì)胞。不加Annexin V/APC，Nuclear Green 。用于調(diào)節(jié)電壓。
② 單染管：有明顯凋亡的細(xì)胞，只加Annexin V/APC染色。用于調(diào)節(jié)補償。
③ 單染管：有明顯凋亡的細(xì)胞，只加Nuclear Green 染色。用于調(diào)節(jié)補償
④ 檢測管：待測的處理細(xì)胞，加Annexin V/APC，Nuclear Green 。用空白管和單陽管調(diào)節(jié)好電壓補償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。

（II） 轉(zhuǎn)染GFP細(xì)胞
① 未轉(zhuǎn)染空白管：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，陰性對照組細(xì)胞，沒有染色的細(xì)胞。不加Annexin V/APC，Nuclear Green 。用于調(diào)節(jié)電壓。
② 轉(zhuǎn)染GFP空白管：轉(zhuǎn)染GFP的對照組細(xì)胞，沒有染色的細(xì)胞。不加Annexin V/APC，Nuclear Green 。用于調(diào)補償
③ 未轉(zhuǎn)染單染管：未轉(zhuǎn)染且有明顯凋亡的細(xì)胞，只加Annexin V/APC染色。用于調(diào)節(jié)補償。
④ 未轉(zhuǎn)染單染管：未轉(zhuǎn)染且有明顯凋亡的細(xì)胞，只加Nuclear Green 染色。用于調(diào)節(jié)補償
⑤ 檢測管：待測的處理細(xì)胞，加Annexin V/APC，Nuclear Green 。用空白管和單陽管調(diào)節(jié)好電壓補償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。

【注】：
? 具體流式設(shè)置按常規(guī)方法即可。
請參照流式細(xì)胞儀說明書或咨詢所使用的儀器的技術(shù)支持。

實驗過程中Annexin V染不上色或陽性率偏低?？赡艿脑蛉缦拢?br>1. 用于檢測的流式細(xì)胞儀/顯微鏡設(shè)置不當(dāng)。調(diào)整使用正確的儀器設(shè)置。
2. 確定實驗中的誘導(dǎo)劑是否能產(chǎn)生凋亡?？赏ㄟ^設(shè)定確切凋亡誘導(dǎo)效果的陽性藥物對照來排除這一情況。
3. 細(xì)胞未啟動凋亡。重新確定誘導(dǎo)后凋亡啟動的時間點（時程實驗）。
4. 細(xì)胞數(shù)量偏少。增加細(xì)胞數(shù)量。
5. 貼壁細(xì)胞消化不當(dāng)。Annexin V 跟PS 的結(jié)合需要Ca2+離子，結(jié)合液中含有Ca2+，EDTA 的消化會影響染色，建議使用無EDTA 的，或者消化后用PBS洗滌干凈。

實驗過程中陽性率偏高。可能的原因如下：
1. 用于檢測的流式細(xì)胞儀/顯微鏡設(shè)置不當(dāng)。調(diào)整使用正確的儀器設(shè)置。
2. 細(xì)胞本身活力太差。實驗中發(fā)現(xiàn)未經(jīng)誘導(dǎo)凋亡的對照細(xì)胞經(jīng)染色后AnnexinV+/PI+雙陽性的細(xì)胞比例過高，造成這種結(jié)果的原因可能是細(xì)胞本身活力太差。建議用臺盼藍(lán)染色計算細(xì)胞的活力，臺盼藍(lán)拒染的細(xì)胞應(yīng)大于95%。若活力偏低低，建議重新復(fù)蘇細(xì)胞，通常剛復(fù)蘇的細(xì)胞至少要傳代3 次以后才能進(jìn)行實驗。

1.Hongjuan Li, et al.
Nucleus-targeted nano delivery system eradicates cancer stem cells by combined thermotherapy and hypoxia-activated chemotherapy
Biomaterials 2019 （IF=10.317）

2.Wei Bing, et al.
Programmed Bacteria Death Induced by Carbon Dots with Different Surface Charge
Small 2016 （IF=11.459）

3.Linchong Sun, et al.
cMyc-mediated activation of serine biosynthesis pathway is critical for cancer progression under nutrient deprivation conditions
Cell Research 2015 （IF=20.507） 4.Kerong Deng, et al.
Enhanced Antitumor Efficacy by 808 nm Laser-Induced Synergistic Photothermal and Photodynamic Therapy Based on a Indocyanine-Green-Attached W18O49 Nanostructure
Advanced Functional Materials 2015 （IF=16.836）

5.Wenqiao Zang, et al.
miR-663 attenuates tumor growth and invasiveness by targeting eEF1A2 in pancreatic cancer
Molecular Cancer 2015 （IF=15.302）