化工儀器網
技術文章
聚合酶鏈式反應（PCR）常見的種類簡介
閱讀：177 發(fā)布時間：2024-10-8PCR是聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction）的簡稱，是一種體外擴增特定DNA片段的分子生物學技術。PCR的常見種類分述如下：
1、普通PCR
普通PCR即一代PCR，使用普通PCR擴增儀擴增靶基因，并通過瓊脂糖凝膠電泳對產物進行定性分析。
2、實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）
實時熒光定量PCR，也叫Real-Time PCR，即二代PCR，是指在PCR擴增反應體系中加入熒光染料或者熒光基團，在整個PCR過程中通過收集熒光信號實時監(jiān)測每一個循環(huán)中擴增產物量的變化，最后通過標準曲線和CT值對待測樣品進行定量分析。qPCR常用的有兩種方法：SYBR Green法和TaqMan探針法。
①熒光染料法（SYBR Green）：SYBR Green Ⅰ是熒光定量PCR中zui 常用的熒光染料，它能與所有的雙鏈DNA結合。在PCR反應體系中，加入SYBR Green Ⅰ，它就會在過程中與雙鏈DNA結合，從而產生熒光信號。因此，反應中發(fā)出的全部熒光信號就會與反應中雙鏈DNA的量呈正比，熒光強度也會隨著產物的增加而增加。但是由于染料與雙鏈DNA是非特異性結合，因此可能產生假陽性的結果。
優(yōu)點：價格相對較低；使用方便；對DNA模板沒有選擇，通用性好；檢測靈敏度高。
缺點：可能產生假陽性結果，需要通過熔解曲線分析識別擴增產物的特異性；需要不斷優(yōu)化反應體系以降低非特異性擴增；不適合進行多重qPCR檢測。
②熒光探針法（TaqMan技術）：TaqMan探針是最早用于定量的方法，也是臨床檢測中zui常用的檢測方法。PCR擴增時，加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針。該探針是一個寡核苷酸，5'端標記一個熒光報告基團（Reporter, R），3'端標記一個淬滅基團（Quencher, Q）。當探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，以至于無法檢測到熒光信號；而當PCR擴增時（在延伸階段），探針會被Taq酶的5'→3'外切酶活性酶切降解，使報告基團和淬滅基團分離，報告基團發(fā)射底的熒光不會再被吸收，從而可以在熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號，即每擴增一條DNA，就形成一個熒光分子，PCR產物的形成與熒光分子的形成wan全同步，PCR產物越多，熒光信號累積的越多，熒光強度越大。
優(yōu)點：檢測特異性強；靈敏度高；適合進行多重qPCR檢測；PCR后續(xù)無需處理，節(jié)省時間和原料成本。
缺點：需要根據不同的序列，合成不同的探針；探針的水解依賴Taq酶外切酶的活性，定量時容易受試劑和酶性能影響；淬滅難以徹di，本底較高；檢測結果很難判斷實際的擴增特性。
熒光染料法和熒光探針法的工作原理
注：多重PCR，也稱多重引物PCR或復合PCR，是在一個反應體系中加入兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的一種新型PCR擴增技術。
3、數字PCR（Digital PCR, Dig-PCR, dPCR）
數字PCR即三代PCR，是對原始PCR的另一種改進，是一種能夠實現(xiàn)核酸絕對定量的精準檢測技術，基于泊松分布原理將核酸樣品分配到大量獨立、平行的微反應單元（納升級）中，使每個反應室中平均只有一個拷貝或者沒有目標DNA分子，然后加入熒光信號進行擴增，從而實現(xiàn)靶標核酸分子的絕對計數，提高檢測靈敏度和準確度。
4、逆轉錄PCR（ReverseTranscription-PCR,RT-PCR）
逆轉錄PCR也叫反轉錄PCR，將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增相結合，是PCR的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中首先經反轉錄酶將一條單鏈RNA逆轉錄成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。無論使用何種RNA，關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。RT-PCR技術靈敏且應用廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。一般通過一步法或兩步法進行，一步法是RT反應和PCR反應在同一試管中進行；而在兩步法中兩個反應是分開依次進行的。
5、實時熒光定量逆轉錄PCR（Real-time RT-PCR,RT-qPCR）
Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的組合，其中的“RT"是Reverse transcription（逆轉錄）的意思，所以RT-qPCR就是結合了熒光定量技術的逆轉錄PCR，即以mRNA或總RNA為模板，先反轉錄得到cDNA，再以cDNA為模板，通過熒光定量PCR進行定量檢測分析。因為RT-PCR只可以定性，但不能進行定量分析。與RT-PCR一樣，RT-qPCR定量分析RNA也有兩種方法：一步法和兩步法。兩種方法都需要先將RNA反轉錄為cDNA，然后再將其作為qPCR擴增的模板，只是一步法中的RT和qPCR在同一試管中進行，兩步法中的RT和qPCR是按順序分開進行。