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聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)重難點解讀
閱讀：142 發(fā)布時間：2024-9-2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)是在體外進(jìn)行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)：①模板核酸的制備；②引物的質(zhì)量與特異性；③酶的質(zhì)量；④PCR條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析檢測。
1、 模板
a．模板質(zhì)量不佳，含有雜蛋白質(zhì)，特別是染色體中的組蛋白；模板核酸變性不夠；提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。建議選擇質(zhì)量可靠的提取試劑，重新提取高純度基因組模板；若模板為cDNA，需要檢查逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及其所用RNA的純度及完整度。
b．模板中含有尿嘧啶抑制高保真酶的活性，或含有Taq酶抑制劑。
c．模板濃度過高，或含有一些buffer，抑制PCR擴增，如cDNA模板，建議稀釋后再使用。
d．靶序列變異。如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，導(dǎo)致PCR不能有效擴增。
2、引物：引物的設(shè)計、引物質(zhì)量是PCR擴增成敗的關(guān)鍵。
a．引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠、引物之間形成二聚體等，需要重新設(shè)計引物。
b．合成高質(zhì)量、高純度級別的引物。
c．引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期4℃保存，導(dǎo)致引物降解失效。
3、 酶的質(zhì)量：
a．酶失活，建議更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或活性降低而導(dǎo)致沒有產(chǎn)物。
b．酶擴增效率低，建議更換擴增效率高的酶。
4、 PCR條件:
a．PCR擴增條件：變性對PCR擴增相當(dāng)重要，如變性溫度低、變性時間短都有可能出現(xiàn)擴增無產(chǎn)物；退火溫度過低，可導(dǎo)致非特異性擴增而降低特異性擴增效率；退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。
b．Mg2+濃度：Mg2+濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高會降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗。
c．反應(yīng)體系：反應(yīng)體系配制錯誤，建議重復(fù)實驗。通常進(jìn)行PCR預(yù)實驗采用的是小體系，正式實驗如需擴大體系時，一定要重新摸索條件，否則容易出現(xiàn)擴增效果不理想或者失敗。
操作步驟:
準(zhǔn)備好各種試劑和PCR儀，就可以開始PCR實驗：將各種試劑混合并按照說明書設(shè)置PCR反應(yīng)。一般PCR循環(huán)如下：
1. 起始步驟：這對于熱啟動PCR而言是必須的，將反應(yīng)混合液加熱至94-98度以激活DNA聚合酶。這一步的時間取決于所選用的DNA聚合酶。
2. 變性步驟：DNA本身是雙鏈結(jié)構(gòu)，而DNA擴增需要引物與單鏈DNA模板相結(jié)合。在這一步，反應(yīng)混合液被加熱至94-98度保持20-30秒以破壞雙鏈間的氫鍵以便釋放出單鏈DNA。這是PCR循環(huán)中的第一步。
3. 退火步驟：變性之后，DNA模板以單鏈的形式在反應(yīng)混合液中存在。因為反應(yīng)體系中的引物與DNA模板互補，當(dāng)反應(yīng)溫度降至50-65度時，引物與互補的序列形成氫鍵。退火溫度主要取決于引物的Tm值，通常比引物Tm值低3-5度。這一步通常維持20-40秒，而聚合酶會結(jié)合至引物-模板雙鏈處開始DNA合成。
4. 延伸步驟：在這一步，DNA聚合酶開始DNA合成，因此這一步的溫度選取的是DNA聚合酶的 優(yōu)溫度。通常我們選用72度，但某些DNA聚合酶的最適溫度是68度。這一步與體內(nèi)的DNA復(fù)制很相似：DNA聚合酶按照堿基互補規(guī)律將dNTPs加到引物的3’末端最終得到新的DNA雙鏈片段。延伸時間取決于目的DNA片段的長度和DNA聚合酶的合成能力。一般而言DNA聚合酶每60秒能夠合成1kb長度的DNA。
5. 第2步至第4步稱為一個循環(huán)：每次循環(huán)之后DNA的量均是前一次的兩倍。通常一次PCR反應(yīng)進(jìn)行30-35個循環(huán)。在前幾輪的PCR循環(huán)過程中PCR產(chǎn)物的量以指數(shù)速率增長，但是到了反應(yīng)后期隨著dNTPs和引物的量的減少以及DNA聚合酶的失活，反應(yīng)速率逐漸下降，因此PCR反應(yīng)的產(chǎn)量也受到了限制。
6. 最后的延伸步驟：當(dāng)30-35個循環(huán)結(jié)束后，我們通常會以68-74度延伸5-10分鐘，這是希望使反應(yīng)體系中殘留的單鏈DNA全部反應(yīng)完畢。
7. 維持時間：通常我們設(shè)置4-10度為反應(yīng)后PCR產(chǎn)物的保存溫度。