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合成培養(yǎng)基的主要成分及配制步驟
閱讀：286 發(fā)布時(shí)間：2024-7-22 細(xì)胞培養(yǎng)基的種類(lèi)很多，按其來(lái)源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基(目前使用的培養(yǎng)基絕大部分是合成培養(yǎng)基)，按其物質(zhì)狀態(tài)分為干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類(lèi)。干粉培養(yǎng)基需由實(shí)驗(yàn)者自己配制并滅菌，液體培養(yǎng)基由專(zhuān)業(yè)商家提供，用戶(hù)可直接使用，非常方便。
一、合成培養(yǎng)基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽、維生素及其它輔助物質(zhì)：
1、氨基酸
氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同種類(lèi)的細(xì)胞對(duì)氨基酸的要求各異，但有幾種氨基酸細(xì)胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，這幾種氨基酸稱(chēng)為必需氨基酸。其中谷氨酰胺是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)不良而死亡。因此，各種培養(yǎng)液中都有較大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培養(yǎng)液內(nèi)。已含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲(chǔ)存2 周以上時(shí)，還應(yīng)重新加入原來(lái)量的谷氨酰胺。
2、碳水化合物
碳水化合物是細(xì)胞生長(zhǎng)主要能量來(lái)源，其中有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸等。
3、無(wú)機(jī)鹽
培養(yǎng)液中無(wú)機(jī)鹽的主要功能是幫助細(xì)胞維持滲透壓平衡。此外，通過(guò)提供鈉，鉀和鈣離子，幫助細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞膜功能。培養(yǎng)液的滲透壓是一個(gè)非常重要的因素, 細(xì)胞通?？赡褪?60mOsm/kg ～320 mOsm/kg。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液的滲透壓在此范圍內(nèi)波動(dòng)。特別注意：向培養(yǎng)液中加入其它物質(zhì)有可能會(huì)明顯改變培養(yǎng)液的滲透壓，特別是溶于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿中的物質(zhì)。向培養(yǎng)液中添加HEPES 時(shí)需按以下方法調(diào)節(jié)鈉離子濃度。
大多數(shù)細(xì)胞所需pH 在 7.2 - 7.4。但是，細(xì)胞培養(yǎng)適pH 值隨培養(yǎng)的細(xì)胞種類(lèi)不同而不同。成纖維細(xì)胞喜歡較高pH (7.4 - 7.7), 而傳代轉(zhuǎn)化細(xì)胞系則需要偏酸pH (7.0 - 7.4)。
由于多數(shù)培養(yǎng)液靠碳酸氫鈉(NaHCO3)與CO2 體系進(jìn)行緩沖，因此，氣相中的CO2 濃度應(yīng)與培養(yǎng)液中碳酸氫鈉濃度相平衡。如果氣相或培養(yǎng)箱空氣中CO2 濃度設(shè)定在5%，培養(yǎng)液中NaHCO3 的加入量為1.97g/L；如果CO2 濃度維持在10%，培養(yǎng)液中NaHCO3 的加入量為3.95g/L。
細(xì)胞培養(yǎng)瓶蓋不應(yīng)擰得太緊，以保證氣體交換。HEPES 是一種非離子緩沖液，在pH 7.2 - 7.4 范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力，但是非常昂貴，在高濃度時(shí)對(duì)一些細(xì)胞可能有毒。HEPES 緩沖液可與低水平的碳酸鈉(0.34g/L)共用，以抵消因額外加入HEPES 引起的滲透壓增加。在這種培養(yǎng)條件下，細(xì)胞培養(yǎng)瓶的蓋子應(yīng)擰緊，以防止培養(yǎng)液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。大多數(shù)培養(yǎng)液中含有酚紅作為pH 指示劑，酸性培養(yǎng)液呈橙黃色，堿性培養(yǎng)液呈深紅色。
4、維生素
在細(xì)胞培養(yǎng)中，盡管血清是維生素重要來(lái)源， 但是許多培養(yǎng)基中添加了各種維生素以適合更多的細(xì)胞系生長(zhǎng)。
5、其它成分
在一些較為復(fù)雜的培養(yǎng)液中還包括其它一些成分。如在雜交瘤技術(shù)中常用的DMEM 培養(yǎng)液，使用時(shí)還需要補(bǔ)加丙酮酸鈉和2-C2H6OS(2-Mercaptoethanol，2-Me)。2-Me 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有很重要的作用。有人認(rèn)為它相當(dāng)于胎牛血清，有直接刺激細(xì)胞增殖作用。2-Me的活性部分是硫氫基，其中一個(gè)重要作用是使血清中含硫的化合物還原成谷胱甘肽，能誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖，為非特異性的激活作用。同時(shí)避免過(guò)氧化物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的損害。另一個(gè)重要作用是促進(jìn)分裂原的反應(yīng)和DNA 合成，增加植物凝集素(PHA)對(duì)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用，已廣泛應(yīng)用于雜交瘤技術(shù)，另外，也開(kāi)始用于一些難以培養(yǎng)的細(xì)胞。2-Me 是一種小分子還原劑，極易氧化。分子量為78.13，純的2-Me 是一種無(wú)色有刺激味的液體，比重為1.110-1.120(Do20)，常用終濃度為5×10-5M。常配制成0.1M 的儲(chǔ)存液，用時(shí)每升培養(yǎng)液加0.5ml。
二、配制步驟
①、將干粉型培養(yǎng)基溶于欲配制液體總量2/3的三蒸水，沖洗包裝袋兩次倒入培養(yǎng)液中，加人磁性攪棒并置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢瑁源_保培養(yǎng)基干粉充分溶解。
②、按照產(chǎn)品包裝說(shuō)明的要求和實(shí)驗(yàn)需要補(bǔ)加 NaHCO3和谷氨酰胺。
③、加入抗生素：最終濃度為青霉素100U/mL，鏈霉素100ug/mL。（一般市售的青霉素為80萬(wàn)單位/瓶，將其溶解于4 mL三蒸水中，每升培養(yǎng)液中加人0.5 mL；市售鏈霉素為1g/瓶，將其溶解在5mL中，每升培養(yǎng)液加人0.5 mL。）
④、加入所需濃度的經(jīng)56℃水浴滅活的胎牛（或其他）血清，補(bǔ)加三蒸水至最終體積。（目前，血清均經(jīng)過(guò)無(wú)菌處理。）
⑤、調(diào)整培養(yǎng)液pH值：一般情況下市售干粉型培養(yǎng)基溶解后，pH值都有一相對(duì)穩(wěn)定的數(shù)值，但某些因素例如配制液體使用的三蒸水、加人不同濃度的血清、采用CO2加壓過(guò)濾等，有可能使所配制液體的pH有所改變。因此，配制過(guò)程中，應(yīng)強(qiáng)調(diào)采用新鮮制備的三蒸水并在加人血清后調(diào)整pH值，過(guò)濾除菌時(shí)宜采用O2加壓過(guò)濾。常規(guī)配制培養(yǎng)液時(shí)pH值常略偏堿，可采用HCI溶液進(jìn)行調(diào)整，使用時(shí)可將預(yù)先配制的HCI溶液逐滴緩慢加入欲調(diào)整的偏堿的液體中并攪拌均勻，用pH計(jì)或pH精密試紙觀察調(diào)整結(jié)果達(dá)到pH7.2~7.4。
⑥、將上述溶液用過(guò)濾法消毒除菌。所使用的濾器采用0.22 um和0.45 um濾膜各1張，常規(guī)高壓滅菌消毒。
⑦、將經(jīng)過(guò)濾除菌的培養(yǎng)液分裝于貼有標(biāo)簽的無(wú)菌貯液瓶中，加蓋瓶塞，加封75%乙醇浸泡的玻璃紙，4℃存放。
三、注意事項(xiàng)
①配制培養(yǎng)液以及調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH值所使用的HCl和 NaOH等溶液需新鮮制備的三蒸水，一般于配制當(dāng)天制備，以保證水的純度和質(zhì)量。
②配制培養(yǎng)基的各種器皿都應(yīng)徹di清洗，烤干后備用。
③培養(yǎng)液配制過(guò)程中一般不需加熱助溶。
④培養(yǎng)液配制后應(yīng)進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)，以檢測(cè)培養(yǎng)液是否有污染。配制培養(yǎng)液所需血清的質(zhì)量應(yīng)保持穩(wěn)定，同一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)應(yīng)盡可能采用同一批號(hào)血清。
⑤每批次配制液體數(shù)量以使用2周左右為宜，以免時(shí)間過(guò)長(zhǎng)造成營(yíng)養(yǎng)成分損失。