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揭秘ELISA試驗(yàn)出現(xiàn)“花板”現(xiàn)象原因
閱讀：143 發(fā)布時(shí)間：2024-7-1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay， ELISA)于1971年分別由瑞典學(xué)者和荷蘭學(xué)者報(bào)道，開(kāi)創(chuàng)了運(yùn)用酶標(biāo)記免疫技術(shù)進(jìn)行液體標(biāo)本中微量物質(zhì)測(cè)定的實(shí)驗(yàn)方法。其原理是抗原或抗體的固相化及抗原抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。該實(shí)驗(yàn)因其靈敏度較高，特異性較好，操作較簡(jiǎn)單，可大批量操作而廣泛應(yīng)用于多種傳染性疾病的篩查工作中。然而，“花板"現(xiàn)象的出現(xiàn)，往往會(huì)給實(shí)驗(yàn)者判讀結(jié)果帶來(lái)麻煩。所謂“花板"，就是空白、陰性、陽(yáng)性對(duì)照及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常，而標(biāo)本孔的OD值卻偏高，弱陽(yáng)性結(jié)果較多。現(xiàn)對(duì)“花板"現(xiàn)象進(jìn)行了分析和總結(jié)，認(rèn)為花板原因大多在樣品，解決辦法主要在洗滌，孵育和顯色過(guò)程也會(huì)導(dǎo)致。
一、 花板原因大多在樣品
所謂“花板"，就是空白、陰陽(yáng)性對(duì)照及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常，而標(biāo)本孔的OD值卻偏高。之所以空白、對(duì)照及質(zhì)控結(jié)果正常而標(biāo)本孔異常，是因?yàn)闃悠繁旧淼脑?，大部分或全部?biāo)本孔的OD值偏高，很可能是因?yàn)闃悠分心承┕灿械奈镔|(zhì)非特異性的吸附于固相載體，而在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中未被除去。
1、待測(cè)血清中混有紅細(xì)胞或纖維蛋白原 這兩種物質(zhì)易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈，李文，卓瑪?shù)热耍?,2］實(shí)驗(yàn)表明在較高的離心轉(zhuǎn)速(3000 /min)和較長(zhǎng)的離心時(shí)間(>10 min)之下，血液標(biāo)本被充分地離心分離之后，使紅細(xì)胞和纖維蛋白充分沉淀，可以在加樣時(shí)避免加入紅細(xì)胞和纖維蛋白，避免這兩種干擾物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，就可避免“花板"情況。
2、 高IgG血癥 在實(shí)際工作中，筆者發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)丙肝的實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)花板的情況較多，原因之一是因?yàn)槟壳皣?guó)內(nèi)外的抗-HCV EIA試劑均采用間接酶聯(lián)免疫檢測(cè)原理，間接法的一個(gè)重要影響因素是血清中所含的高濃度的非特異性IgG，IgG對(duì)聚苯乙烯有較強(qiáng)的吸附力，非特異性IgG可吸附到固相載體上或包被的抗原上造成假陽(yáng)性。
二、 解決辦法主要在洗滌
聚苯乙烯因其具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能而被廣泛用于ELISA實(shí)驗(yàn)的固相載體，聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，因此需要通過(guò)洗滌清除在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗滌在 ELISA 過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。上述提到的血清中存在紅細(xì)胞或纖維蛋白原，可以在加樣前離心時(shí)得到控制，同樣也可以通過(guò)適當(dāng)增加洗滌次數(shù)和浸泡時(shí)間減輕或避免對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，同樣，對(duì)于血液存在的非特異性的IgG,實(shí)驗(yàn)者很難在加樣時(shí)將其去除，那么解決的最佳時(shí)機(jī)就是洗滌過(guò)程。
ELISA在洗滌過(guò)程中需注意以下幾點(diǎn)：
1、板要平整，尤其是在用洗板機(jī)洗板的過(guò)程中，往往是3排一起洗，如果板不平，就很可能造成洗液有殘留，從而導(dǎo)致非特異性結(jié)合不能清除干凈，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾。
2、洗液溫度，實(shí)驗(yàn)表明，洗液溫度也會(huì)影響洗板的干凈程度，尤其是冬天溫度過(guò)低時(shí)容易出現(xiàn)“花板"問(wèn)題。因此，最好保持室溫在20℃-30℃。
3、洗液要注滿(mǎn)孔，孔壁洗滌不干凈也易造成“花板"現(xiàn)象。
4、洗液要新鮮配置，洗液要臨用前新鮮配制，放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易產(chǎn)生絮狀物或混濁，造成賭孔或花板。
5、洗板次數(shù)不夠或洗滌間隔時(shí)間過(guò)短也會(huì)造成由于洗板不凈而造成“花板"。
三、 孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)造成“花板"
本實(shí)驗(yàn)室曾有一段時(shí)間經(jīng)常出現(xiàn)丙肝檢測(cè)“花板"現(xiàn)象，究其原因是由于樣本較多，加樣后未及時(shí)放入孵育箱，反應(yīng)板在室溫呆的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，即間接增加了孵育時(shí)間，導(dǎo)致孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，蛋白質(zhì)非特異性吸附于固相載體。因此，應(yīng)嚴(yán)格控制加樣時(shí)間，加樣后及時(shí)孵育，標(biāo)本較多時(shí)可分批操作。
此外，有些的試劑顯色液不穩(wěn)定，使用前容易變藍(lán)，如在實(shí)驗(yàn)前不仔細(xì)檢查，很容易導(dǎo)致“花板"現(xiàn)象的發(fā)生，這也提醒實(shí)驗(yàn)者應(yīng)使用新鮮的顯色液，很大程度的保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
綜上所述，將ELISA“花板"現(xiàn)象總結(jié)為：花板原因大多在樣品，解決辦法主要在洗滌，孵育和顯色過(guò)程也會(huì)導(dǎo)致。既然原因大多在樣品，那么在樣品交接時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)定，無(wú)溶血，無(wú)凝血，足量，單個(gè)的溶血樣品雖不致造成“花板"，但血紅蛋白中的血紅素基團(tuán)，具有類(lèi)過(guò)氧化物的活性，在以辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)為標(biāo)記酶的ELISA測(cè)定中，易在孵育過(guò)程中吸附于固相，從而與后面加入的底物反應(yīng)顯色，從而造成假陽(yáng)性。洗滌是ELISA的關(guān)鍵步驟，充分有效的洗滌也是避免“花板"的有利措施。同樣，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明孵育，使用新鮮的顯色液也是有效避免“花板"的保障。以上措施可以有效減少“花板"次數(shù)，從而提高檢測(cè)的特異性和準(zhǔn)確性，更好的發(fā)揮ELISA的方法學(xué)優(yōu)勢(shì)。