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蛋白濃度測定三種常見方法操作要點
閱讀：274 發(fā)布時間：2023-11-20一、酪安酸差色光譜法：
1. 打開分光光度劑，預(yù)熱30分鐘，是紫外燈處于穩(wěn)定發(fā)光狀態(tài)
2. 在2容積為1mlde 微量石英比色杯中分別加入900ulPH7.4,PH12.0的0.1mol/l磷酸緩沖液，把盛有PH12.0緩沖液的比色杯放入樣品杯中放入支架上，把盛有PH7.4緩沖液的比色杯放入到參比杯的支架上，然后準(zhǔn)確的測出295nm波長下的光吸收值，或用250－350nm掃描
3. 在上述的2個比色杯中分別加入100UL的待測樣品液，小心振蕩混勻
4. 重復(fù)2操作
5. 計算蛋白濃度：﹝(PH為12.0A295-PH為7.4A295)/2.330×N﹞×W
N是蛋白分子中酪安酸毫摩爾消光系數(shù)之差
W是樣品稀釋倍數(shù)
二、紫外光吸收法測定蛋白濃度：
1．用品和儀器：紫外分光光度劑，微量自動取液儀
2．試劑：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：準(zhǔn)確稱重的純凈蛋白質(zhì)，配成1mg/ml儲液置于4度中備用
0.1mol/l磷酸緩沖液，PH7.4;0.1mol/l磷酸緩沖液，PH12.0
3.試驗程序：
1，在2個潔凈干凈的石英比色杯中（內(nèi)徑1cm）中加入蒸餾水或其他用于溶解標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)與待測樣品的緩沖液，其中一個作為參比杯（在以后測量不變），另一個作為樣品杯，放入分光光度劑的相應(yīng)位置
2，記錄下空白杯在280260nm處的光吸收值，或?qū)χM(jìn)行250－350nm波長范圍的基線掃描
3，移去樣品比色杯中的蒸餾水或是緩沖液，干燥比色杯（用濾紙吸取殘液）
4，在樣品比色杯中加入待測樣品液，在實驗中提取樣品30ul加入2970ul雙證水，混勻，樣品液事先通過離心或用0.2um孔徑的濾膜過濾
5，重復(fù)2步驟
6．蛋白含量計算：蛋白濃度（mg/ml）=1。55A280—0.76A260
三、Folin法測定蛋白含量：
1.用品和儀器：分光光度劑，試管及試管架，微量自動取液儀（20，100，200，1000UL）
2.試劑：試劑甲：貯液A(4g/100mlNa2CO3),貯液B(0.2mol/100lNaOH),貯液C(1g/100mlCuSO4.5H2O),貯液D（2g/100ml 酒石酸鉀鈉）臨用前將A和B等體積混合為碳酸鈉－氫氧-化鈉溶液，C與D混合盛Folin-酚試劑甲，一天內(nèi)有效
試劑乙：取烏酸鈉100G，目酸鈉25G，置于2000ml膜口回流裝置內(nèi)，加蒸餾水700ml，85％磷酸50ml和濃鹽酸100ml，充分混勻，使其溶解。小火加熱，回流10小時（燒瓶中加入玻璃珠以防溶液外濺）再加入硫酸鋰150g蒸餾水50ml及液-溴數(shù)滴，在通風(fēng)廚開口煮沸15分鐘，以除去多余的溴，冷卻后定容與1000ml，過濾即成Folin-酚試劑乙貯存液，顏色為鮮黃色，置于棕色瓶中，可在冰箱長期保存，顏色變綠，在加幾滴溴，煮沸數(shù)分鐘，恢復(fù)原色試劑乙在使用前應(yīng)該確定其酸度，使之滴定標(biāo)準(zhǔn)氫氧-化鈉試劑(1mol/l),以酚酞為指示劑，當(dāng)溶液顏色由紅－紫紅－紫灰－墨綠即可為終點，酸度為2MOL/L將其稀釋到1mo/l即可
標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：精-確稱取結(jié)晶牛血清蛋白3mg溶于雙證水中，定容于10ML,濃度為0.3mg/ml
3.實驗方法：1.取16mm*150mm試管13支，標(biāo)明號碼，放置與試管架，在1－11號試管中分別加入標(biāo)準(zhǔn)牛蛋白血清（0.3mg/ml）0,0.1,0.2--------1.0ml,補足雙蒸水至每管體積1.0ml，在12，13管中加入待測樣品100UL，并補足雙蒸水至1.0ml
3. 加入5.0ml新配置的試劑甲，立即混勻，在室溫下放置10分鐘
4. 各管中加入0.5ml試劑乙，充分混勻，（用振蕩器），然后室溫放置30－60min
5. 將標(biāo)準(zhǔn)樣及待測樣品在可見光光度計上比色，如果蛋白含量低于500UG/ML,在750nm下比色，如果在100ug/ml之內(nèi)，則在550nm波長下比色
6. 根據(jù)已知含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品測得的光吸收值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)待測樣品的光吸收值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出蛋白含量