大鼠肝星狀細胞

一、細胞基本屬性

培養(yǎng)基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

傳代特性：可傳5代左右；3代以內狀態(tài)佳

消化液：0.25%胰dan白酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

傳代比例：1:2

細胞簡介：大鼠肝星形細胞分離自肝臟組織；肝臟是身體內以代謝功能為主的一個器官，并在身體里面起著去氧化、儲存肝糖、分泌性蛋白質的合成等作用；肝臟也制造消化系統(tǒng)中之膽汁。肝臟是機體內臟里大的器官，位于機體中的腹部位置，在右側橫隔膜之下，位于膽囊之前端且于右邊腎臟的前方，胃的上方。肝臟是機體消化系統(tǒng)中大的消化腺，為一紅棕色的V字形器官。肝臟是尿素合成的主要器官，又是新陳代謝的重要器官。肝臟在機體位置和形態(tài)結構：肝臟位于右上腹，隱藏在右側膈下和肋骨深面，大部分肝為肋弓所復蓋，僅在腹上區(qū)、右肋弓間露出并直接接觸腹前壁，肝上面則與膈及腹前壁相接。肝星形細胞(HSC)又名肝貯脂細胞、維生素A貯存細胞、竇周細胞、Ito細胞等，是肝臟細胞外基質的主要來源。HSC在激活后可進一步轉化為肌成纖維細胞樣細胞，各種可導致肝纖維化的因素均將HSC作為終靶細胞。正常情況下，HSC處于靜止狀態(tài)，當肝臟發(fā)生炎癥反應或受到機械刺激等損傷時，HSC的表型由靜止型轉變?yōu)榧せ钚停せ畹腍SC可通過增生和分泌細胞外基質參與肝纖維化的形成及肝內結構的重建，此過程也是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。肝星形細胞分布于肝臟的Disse間隙內，是合成、分泌細胞外基質的主要來源，在肝纖維化的發(fā)生中處于重要地位。肝星形細胞是肝臟的間充質細胞，約占肝臟細胞總數(shù)的8%-13%。作為肝臟合成細胞外基質的主要細胞群，肝星形細胞不僅能分泌蛋白多糖、糖蛋白等細胞外基質成分，合成一定量的膠原酶以維持正常的基底膜結構，還能通過其突起的收縮參與肝竇的微循環(huán)調節(jié)。此外，肝星形細胞能通過合成肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子、表皮生長因子等促進肝細胞增殖和肝再生。
原代細胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機體中取出，經胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細胞，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞繁殖到一定系數(shù)后進行細胞鑒定。

實驗步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二、在超凈工作臺中，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。

四、用細解剖鑷去除大腦白質、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質。

五、大腦皮質放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六、室溫1 000×g離心8min，去上清液。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。

十、靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液。

注意事項：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個月。

2. 在細胞培養(yǎng)過程中，請注意保持無菌操作。

3. 傳代培養(yǎng)過程中，yi酶消化時間不宜過長，否則會影響細胞貼壁及其生長狀態(tài)。

4. 建議客戶收到細胞后前3天每個倍數(shù)各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài)，便于和技術部溝通；由于運輸?shù)脑?，個別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，詳盡告知細胞的具體情況，以便我們的技術人員跟蹤、回訪直至問題得到解決。
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