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實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法原理簡(jiǎn)述
閱讀：192 發(fā)布時(shí)間：2025-1-14目前主流的實(shí)時(shí)熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）方法分為染料法和探針?lè)?，染料法以SYBR Green法為代表，SYBR Green染料游離時(shí)熒光微弱，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)，反應(yīng)管中的熒光強(qiáng)度與反應(yīng)管中雙鏈DNA的數(shù)量成正比例關(guān)系，因此可以通過(guò)檢測(cè)熒光計(jì)算反應(yīng)管中產(chǎn)生的雙鏈DNA（PCR產(chǎn)物）的量，但該方法沒有特異性，非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)物也會(huì)被計(jì)入。對(duì)于探針?lè)▉?lái)說(shuō)，反應(yīng)管中的熒光強(qiáng)度也是檢測(cè)PCR產(chǎn)物量的依據(jù)。但其發(fā)光機(jī)制卻與染料法全不同。
根據(jù)所使用的技術(shù)不同，實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以分為：熒光探針和熒光染料兩種方法。現(xiàn)將其原理簡(jiǎn)述如下：
1. TaqMan熒光探針
TaqMan探針?lè)ㄊ歉叨忍禺惖亩縋CR技術(shù)，其核心是利用Taq酶的3'→5'外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的3'→5'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成wan全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的shou選技術(shù)平臺(tái)。
2. SYBR熒光染料
在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加wan全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過(guò)溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。SYBR熒光染料法定量PCR的基本過(guò)程是：
① 開始反應(yīng)，當(dāng)SYBR染料與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光；
② DNA變性時(shí)，SYBR染料釋放出來(lái)，熒光急劇減少；
③ 在聚合延伸過(guò)程中，引物退火并形成PCR引物；
④ 聚合完成后，SYBR染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)到熒光的凈增量加大。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)根據(jù)化學(xué)原理可以分為探針類和非探針類。探針類實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)主要是利用與靶序列特異雜 交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加；非探針類實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技 術(shù)主要通過(guò)熒光染料來(lái)指示產(chǎn)物的增加。無(wú)論是探針類實(shí)時(shí)熒光 定量 PCR 技術(shù)還是非探針類實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)，檢測(cè)的都是 擴(kuò)增產(chǎn)物的增加量。但探針類實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)增加了識(shí)別 探針的具體的流程，操作的難度較大。