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ELISA（酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)）測(cè)定結(jié)果計(jì)算方法
閱讀：196 發(fā)布時(shí)間：2024-8-19ELISA（酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)）是一種常用的生物化學(xué)分析技術(shù)，用于檢測(cè)特定蛋白質(zhì)或其他生物分子的存在和濃度，ELISA 數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解讀是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中至關(guān)重要的一步。ELISA試劑盒在國(guó)內(nèi)有許多種叫法：例如：ELISA檢測(cè)試劑盒、ELISA Kit、酶聯(lián)免疫試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒、酶聯(lián)免疫分析試劑盒、酶免試劑盒等，比較常見的叫法是ELISA檢測(cè)試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒等。ELISA試劑盒自從60-70年代問(wèn)世以來(lái)，得到世界科研工作者的認(rèn)可及推崇，在歐美及中國(guó)獲得很大的推廣，尤其是國(guó)內(nèi)生化領(lǐng)域的長(zhǎng)足發(fā)展。ELISA生物試驗(yàn)是一種敏感性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法。由于其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果判斷較客觀等因素，已廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)檢驗(yàn)的各領(lǐng)域中。
在 ELSIA中，正常人血清反應(yīng)后?？沙霈F(xiàn)呈色的本底，此本底的深淺因試劑的組成和實(shí)驗(yàn)的條件不同而異，因此實(shí)驗(yàn)中必須加測(cè)陰性對(duì)照。陰性對(duì)照的組成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類似物。在用肉眼判斷結(jié)果時(shí)，更宜用顯色深于陰性對(duì)照作為標(biāo)本陽(yáng)性的指標(biāo)。目視法簡(jiǎn)捷明了，但頗具主觀性。在條件許可下，應(yīng)該用比色計(jì)測(cè)定吸光值，這樣可以得到客觀的數(shù)據(jù)。先讀出標(biāo)本（sample，S）、陽(yáng)性對(duì)照（P）、和陰性對(duì)照（N）的吸光值，然后進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算方法有多種，大致可分為陽(yáng)性判定值法和標(biāo)本與陰性對(duì)照比值法兩類。
1. 陽(yáng)性判定值
陽(yáng)性判定值（cut-off value）一般為陰性對(duì)照A值加上一個(gè)特定的常數(shù)，以此作為判斷結(jié)果陽(yáng)性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)。
用此法判斷結(jié)果要求實(shí)驗(yàn)條件十分恒定，試劑的制備必須標(biāo)準(zhǔn)化，陽(yáng)性和陰性的對(duì)照品應(yīng)符合一定的規(guī)格，須配用精密的儀器，并嚴(yán)格按規(guī)定操作。陽(yáng)性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的系統(tǒng)中通過(guò)對(duì)大量標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)而得到的?，F(xiàn)舉某種檢測(cè) HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對(duì)照品為不含HBsAg的復(fù)鈣人血漿，陽(yáng)性對(duì)照品HBsAg的含量標(biāo)明為P=9±2ng /ml。每次試驗(yàn)設(shè)2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和3個(gè)陰性對(duì)照。測(cè)得A值后，先計(jì)算陰性對(duì)照A值的平均數(shù)（NC X ）和陽(yáng)性對(duì)照A值的平均數(shù)（PCX），兩個(gè)平均數(shù)的差（P-N）必須大于一個(gè)特定的數(shù)值（例0.400），試驗(yàn)才有效。3個(gè)陰性對(duì)照A值均應(yīng)≥0.5×NCX，并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而已另兩個(gè)陰性對(duì)照重新計(jì)算NCX；如有兩個(gè)陰性對(duì)照A值超出以上范圍，則該次實(shí)驗(yàn)無(wú)效。陽(yáng)性判定值按下式計(jì)算：
陽(yáng)性判定值=NCX+0.05
標(biāo)本 A值＞陽(yáng)性判定值的為陽(yáng)性，小于陽(yáng)性判定值的為陰性。應(yīng)注意的是，式中0.05為該試劑盒的常數(shù)，只適合于該特定條件下，而不是對(duì)各種試劑均可通用。
根據(jù)以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照也起到試驗(yàn)的質(zhì)控作用，試劑變質(zhì)和操作不當(dāng)均會(huì)產(chǎn)生"試驗(yàn)無(wú)效"的后果。
2. 標(biāo)本/陰性對(duì)照比值
在實(shí)驗(yàn)條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標(biāo)本（ S）和陰性對(duì)照（N）的A值后，計(jì)算S/N值。也有寫作P/N的，這里的P不代表陽(yáng)性(positive)，而是病人（patient）的縮寫，不應(yīng)誤解。為避免混淆，更宜用S/N表示。在早期的間接法ELISA中，有些作者定出S/N為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)多為各種測(cè)定所沿用。實(shí)際上每一測(cè)定系統(tǒng)應(yīng)該用實(shí)驗(yàn)求出各自的S/N的閾值。更應(yīng)注意的是，N所代表的陰性對(duì)照是不含受檢物質(zhì)的人血清。有的試劑盒中所設(shè)陰性對(duì)照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液，以致反應(yīng)后產(chǎn)生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此，這類試劑盒規(guī)，如N<0.05（或其他數(shù)值），則按0.05計(jì)算，否則將出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。