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    酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA）是免疫學(xué)和分子生物學(xué)中廣泛使用的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，能夠應(yīng)用 ELISA 實(shí)驗(yàn)的樣本種類很多，有血清，血漿，細(xì)胞上清，細(xì)胞裂解液，尿液，關(guān)節(jié)滑液，腦脊液，肺泡灌洗液，各種組織的組織勻漿；采集和處理的方式都不相同。

一、血清 

1、將全血收集到未經(jīng)處理的測(cè)試管中，或者到不含抗凝劑的管中，如 BD 血清用真空采血管。

2、在室溫下連續(xù)孵育 20 分鐘。 

3、4℃ 3,000 rpm 離心 10 分鐘。

4、立即分裝上清液（血漿）并在 -80℃ 下保存樣品。盡可能減少反復(fù)凍融次數(shù)。

二、血漿

1、將全血收集到含抗凝劑的管中，例如 BD 抗凝真空采血管（目錄號(hào)：363080/363080）或添加 0.1M 檸檬酸鈉至 1/10 終體積。

2、4℃ 3,000 rpm 離心 10 分鐘。

3、立即分裝上清液（血漿）并在 -80℃ 下保存樣品。盡可能減少反復(fù)凍融次數(shù)。

 

三、細(xì)胞培養(yǎng)物上清液

1、將培養(yǎng)基移至離心管， 4℃， 1,500 rpm 離心 10 分鐘。

2、立即進(jìn)行上清液的分裝（血清）并在 -80℃ 下保存樣品。盡可能減少反復(fù)凍融次數(shù)

 

四、細(xì)胞提取物

1、將組織培養(yǎng)板放置在冰上。

2、吸出培養(yǎng)基并用預(yù)冷PBS 輕輕洗滌細(xì)胞一次。

3、吸出 PBS ，加入100 mm 培養(yǎng)板加入0.5ml*提取緩沖液。

4、收集細(xì)胞至在傾斜板中，然后移至經(jīng)過預(yù)冷的離心管中。

5、短暫渦旋后在冰上孵育 15-30 分鐘。

6、在 4℃ 下13,000 x rpm 離心 10 分鐘，沉淀不溶性內(nèi)容物。

7、將上清液（這里是指可溶性細(xì)胞提取物）分裝至預(yù)冷的離心管中，并于 -80℃ 保存。盡可能減少反復(fù)凍融次數(shù)。

 

五、條件培養(yǎng)基

1、將細(xì)胞接種到*（含血清）生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，使細(xì)胞增殖達(dá)到一定的融合率。

2、棄去培養(yǎng)基，數(shù)毫升預(yù)熱PBS 小心洗滌。重復(fù)洗滌步驟。

3、棄去PBS 洗滌液并小心加入無血清培養(yǎng)基。

4、孵育 1-2 天。

5、將培養(yǎng)基移至離心管， 4℃ 1,500 rpm 離心 10 分鐘。

6、立即分裝上清液（血清）并在 -80℃ 下保存樣品。盡可能減少反復(fù)凍融次數(shù)。

 

六、乳汁

1、收集樣品并在 4℃ 下以 10,000 x g 離心 2 分鐘。

2、分裝上清液并在 -80℃ 下保存樣品。盡可能減少反復(fù)凍融次數(shù)。

 

七、尿液

1、收集樣品并在 4℃ 下以 10,000 x g 離心 2 分鐘。

2、等分上清液（血清）并在 -80℃ 下保存樣品。盡可能減少凍融循環(huán)次數(shù)

 

八、唾液 

1、收集樣品并在 4℃ 下以 10,000 x g 離心 2 分鐘。

2、立即分裝上清液（血漿）并在 -80℃ 下保存樣品。盡可能減少反復(fù)凍融次數(shù)。

 

九、組織提取物 

1、用干凈的工具解剖組織，最好在冰上、盡快進(jìn)行，以防止被蛋白酶降解。

2、將組織置于圓底的微量離心管中，并浸入液氮中進(jìn)行“速凍"。將樣品保存在 -80℃ 下以便后續(xù)使用或放置在冰上進(jìn)行直接勻漿。 

3、對(duì)于約 5 mg 的組織片，可向管中添加約 300 µl *提取緩沖液（查看細(xì)胞/組織提取緩沖液配方），然后用電動(dòng)勻漿器勻漿。 

4、清洗刀片兩次，每次清洗使用 300µl *提取緩沖液，然后在 4℃ 下維持恒定攪拌 2 小時(shí)（例如置于冷室中的回旋振蕩器上）。 

5、 4℃ 13,000 x rpm 離心 20 分鐘。置于冰上，將上清液（這里是指可溶的蛋白質(zhì)提取物）分裝至新、預(yù)冷的管中并在 -80℃ 下保存樣品。盡可能減少反復(fù)凍融次數(shù)。