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PCR反應(yīng)引物條件優(yōu)化
閱讀：175 發(fā)布時間：2024-6-12PCR（Polymerasechain reaction，聚合酶鏈式反應(yīng)）是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過程，對特定DNA序列進行大量擴增的一種技術(shù)。 PCR反應(yīng)是以4種dNTP為底物，引物引導(dǎo)，DNA聚合酶催化作用下，在單鏈DNA模板3’末端開始進行互補鏈的延伸，多次反復(fù)的擴增使特定DNA序列以指數(shù)增加。PCR反應(yīng)體系參與PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要為包括：引物、酶、dNTP、Buffer、模板和Mg2+。
引物是兩段與待擴增靶DNA序列互補的寡核苷酸片段，兩引物間距離決定擴增片段的長度，兩引物的5’端決定擴增產(chǎn)物的兩個5’末端位置。PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。引物設(shè)計有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(yīng). 引物設(shè)計一般考慮以下幾個方面：
1、引物長度
PCR特異性一般通過引物長度和退火溫度來控制。
引物的長度一般為15-30bp，常用的是18～27bp，最佳為20～24bp。引物過短時會造成Tm值過低，在酶反應(yīng)溫度時不能與模板很好的配對；引物過長時又會造成Tm值過高，超過酶反應(yīng)的最適溫度，還會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進行反應(yīng)。
2、 引物堿基構(gòu)成
引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在，3′端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因為這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。兩個引物中（g+c）%含量應(yīng)盡量相似，在已知擴增片段（g+c）%含量時宜接近于待擴增片段，一般以40%～60%為佳，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。Tm值是一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸互補雙鏈解鏈的溫度。Tm=4（G+C）+2（A+T）。
兩條引物之間避免有同源序列，尤為連續(xù)6個以上相同堿基的寡核苷酸片段，否則兩條引物會相互競爭模板的同一位點；同樣，引物與待擴增目標DNA或樣品DNA的其它序列也不能存在6個以上堿基的同源序列。否則，引物就會與其它位點結(jié)合，使特異擴增減少，非特異擴增增加。
3、引物二級結(jié)構(gòu)
引物應(yīng)避免內(nèi)部形成明顯的二級結(jié)構(gòu)，尤其是發(fā)夾結(jié)構(gòu)。引物自身形成的二級結(jié)構(gòu)包括二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物間二聚體等，會影響引物和模板的結(jié)合從而影響引物效率。特別是在引物的3’末端，盡量避免出現(xiàn)這些二級結(jié)構(gòu)。
4、引物3’端序列
DNA聚合酶是在引物3’端添加單核苷酸，所以，引物3’端5～6個堿基與目標DNA的配對要求必須精確和嚴格，這樣才能保證PCR有效擴增。正、反向引物互相不能互補，尤其是在3’末端，否則容易形成引物二聚體。
引物3’末端的穩(wěn)定性由引物3’末端的堿基組成決定，一般考慮末端5個堿基的ΔG。?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當選用3’端?G值較低（絕對值不超過9），負值大，則3’末端穩(wěn)定性高，擴增效率更高。引物的3’端的?G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。
如擴增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增特異性與效率。應(yīng)當避免在引物的3’端使用堿基A，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基。
5、引物的5′端
引物的5′端限定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、di高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。對于引入一至兩個酶切位點，應(yīng)在后續(xù)方案設(shè)計完畢后確定，便于后期的克隆實驗，特別是在用于表達研究的目的基因的克隆工作中。
6、引物的特異性
引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源，特別是與待擴增的模板DNA之間要沒有明顯的相似序列。