羥脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）是一種非必需亞氨基酸，主要存在于動(dòng)物的膠原蛋白和彈性蛋白中。在植物細(xì)胞壁中，富含羥脯氨酸的蛋白質(zhì)被用作糖鏈的附著點(diǎn)。羥脯氨酸在膠原蛋白中通過(guò)增強(qiáng)其機(jī)械穩(wěn)定性發(fā)揮功能。在疾病狀態(tài)下（如肝纖維化、佩吉特病、骨轉(zhuǎn)移等），通過(guò)測(cè)量水解產(chǎn)物或血清和尿液中的羥脯氨酸水平，可以評(píng)估膠原蛋白的形成和代謝。

AkrivisBio的羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒主要用于檢測(cè)蛋白質(zhì)和組織水解產(chǎn)物中的羥脯氨酸。血清和尿液經(jīng)過(guò)適當(dāng)預(yù)處理后也可作為檢測(cè)樣本。該試劑盒提供了一種簡(jiǎn)單的羥脯氨酸測(cè)量方法，生成的顯色劑可在550-565納米波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)量，適用于1-20微克膠原蛋白或約0.1-2微克羥脯氨酸的檢測(cè)。

艾美捷羥脯氨酸測(cè)定試劑盒#MA-0101檢測(cè)原理：

1.樣本在酸中c底水解。

2.羥脯氨酸被氯胺T氧化為吡咯。

3.吡咯隨后與艾氏試劑（Ehrlich’sReagent）反應(yīng)生成顯色物質(zhì)。

檢測(cè)試劑：

-氧化緩沖液：10毫升

-氯胺T濃縮液：0.6毫升

-酸/異丙醇溶液：5毫升

-DMAB濃縮液：5毫升

-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（1毫克/毫升）：0.1毫升

-微孔板封口膜：1張

用戶自備試劑和設(shè)備：

-12摩爾/升鹽酸

-96孔透明平底板

-烤箱或熱板

-聚丙烯試管

儲(chǔ)存和處理：

將試劑盒儲(chǔ)存于+4°C。使用前短暫離心小瓶。閱讀完整協(xié)議后再進(jìn)行檢測(cè)。

-氯胺T試劑：每孔加入6微升氯胺T濃縮液至94微升氧化緩沖液中，混合均勻。

-DMAB試劑：每孔加入50微升DMAB濃縮液至50微升酸/異丙醇溶液中，混合均勻。

-注意：為獲得最佳結(jié)果，建議在2-3小時(shí)內(nèi)使用稀釋后的試劑。

檢測(cè)步驟：

1.樣本準(zhǔn)備：將樣本用100微升去離子水/10毫克組織勻漿化。在耐壓試管（如Nalgene微型試管）中加入等體積濃鹽酸（約12N，未提供），混合均勻后在120°C下水解3小時(shí)。尿液樣本也用等體積濃鹽酸處理并同樣水解。之后，尿液樣本需用活性炭（1毫克/50微升尿液/鹽酸混合物）處理，離心3分鐘以去除活性炭。將每個(gè)水解后的樣本10微升轉(zhuǎn)移到96孔板中，并在熱源和/或真空中蒸發(fā)至干燥。

-注意：內(nèi)源性化合物可能干擾反應(yīng)。為確保準(zhǔn)確測(cè)定樣本中的羥脯氨酸，建議向樣本中加入已知量的標(biāo)準(zhǔn)品（0.4微克）。

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線：將羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至40微克/毫升，方法是將10微升1毫克/毫升的標(biāo)準(zhǔn)品加入240微升去離子水中，混合均勻。將0、5、10、15、20、25微升分別加入一系列孔中，每種濃度雙孔。這將得到一個(gè)0-0.2-0.4-0.6-0.8-1微克/孔的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.氧化反應(yīng)：向每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入100微升氯胺T試劑，室溫下氧化反應(yīng)5分鐘。

4.顯色反應(yīng)：向每個(gè)孔中加入100微升DMAB試劑，蓋上孔板封口膜，在60°C下反應(yīng)30-40分鐘，使顏色w全顯色。

-注意：氯胺T試劑和DMAB試劑密度差異大，不易混合。封板前，每個(gè)孔上下吸打2-3次以混合均勻。顯色反應(yīng)在約30分鐘時(shí)達(dá)到最大值。如果反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，顏色會(huì)褪去。顏色在室溫下可保持穩(wěn)定。

5.測(cè)量：在560納米處測(cè)量吸光度。

6.計(jì)算：從所有讀數(shù)中減去0微克羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線的斜率定義了系統(tǒng)的靈敏度。將背景校正后的樣本讀數(shù)除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，以確定測(cè)試孔中的羥脯氨酸量。通過(guò)以下步驟推算回原始樣本中的量：

-A.將孔中的羥脯氨酸量除以加入孔中的樣本體積（微升）=樣本中羥脯氨酸/樣本微升

-B.將樣本中羥脯氨酸/樣本微升乘以1中樣本的總體積=樣本中總羥脯氨酸

-C.將樣本中總羥脯氨酸乘以處理過(guò)程中產(chǎn)生的任何稀釋因子。

-D.將樣本中總羥脯氨酸除以處理前的組織毫克數(shù)或液體樣本體積=樣本中羥脯氨酸/組織毫克等。

-注意：許多代謝物和其他化學(xué)物質(zhì)可能會(huì)顯著干擾各種反應(yīng)化學(xué)。為了更精確的測(cè)定，在沒(méi)有樣本和有恒定量樣本的情況下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線。沒(méi)有必要運(yùn)行所有六個(gè)標(biāo)準(zhǔn)；使用最少的3個(gè)（0-10-20微升）來(lái)驗(yàn)證吸光度響應(yīng)是否與分析物量呈線性關(guān)系。兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率應(yīng)該相同。它們之間的吸光度偏差歸因于樣本中的分析物量（當(dāng)前情況下的羥脯氨酸）。如果兩個(gè)斜率不同，則存在矩陣效應(yīng)影響反應(yīng)化學(xué)。在這種情況下，確定0標(biāo)準(zhǔn)之間的吸光度差異，并將其應(yīng)用于在樣本存在的情況下運(yùn)行的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

具有大矩陣效應(yīng)的樣品示例（右圖）：

0標(biāo)準(zhǔn)之間的差異為0.35。在樣本存在的情況下，斜率為0.226吸光度/微克。具有基質(zhì)效應(yīng)的樣本中羥脯氨酸的量為0.35吸光度/0.226吸光度/微克 = 1.55微克。