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RIP(RNA Immunoprecipitation)和RNA pull-down等實(shí)驗(yàn)技術(shù)是我們深入研究RNA和蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)鍵工具。RIP運(yùn)用目標(biāo)蛋白的特異性抗體分離純化與蛋白相互作用的RNA，RNA pull-down通過RNA探針捕獲與之相互作用蛋白質(zhì)。上文我們詳細(xì)了解了RIP技術(shù)，今天帶大家了解一下RNA pull-down技術(shù)。

RNA pull-down

RNA pull-down是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白/RNA結(jié)合情況的技術(shù)。先將RNA進(jìn)行標(biāo)記（如生物素標(biāo)記），再與細(xì)胞裂解液共同孵育，從而形成RNA-RNA/蛋白質(zhì)復(fù)合物，進(jìn)而檢測與之結(jié)合的RNA或蛋白質(zhì)。復(fù)合物洗脫后，通過熒光定量PCR(RNA pull down-QPCR)或高通量測序(RNA pull down-seq)方法來鑒定目標(biāo)RNN是否與某些RNA分子相互作用，通過Western blot(pull down-WB)實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜(pull down--MS)技術(shù)檢測目標(biāo)RNA是否與某些蛋白相互作用。

RNA Pull down技術(shù)原理

RNA pull down實(shí)驗(yàn)的大致流程：

1、探針制備

設(shè)計(jì)并合成含有T7啟動(dòng)子的特異性引物。

使用含有目的基因的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

利用PCR產(chǎn)物作為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得目的RNA。

對目的RNA進(jìn)行標(biāo)記，通常使用生物素標(biāo)記。

2、細(xì)胞裂解液準(zhǔn)備

收集細(xì)胞并裂解，制備細(xì)胞裂解液。

通過離心去除細(xì)胞碎片，收集上清液。

3、RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物形成

將標(biāo)記的RNA探針與細(xì)胞裂解液混合，在適宜條件下孵育，使得RNA與潛在的蛋白質(zhì)結(jié)合并形成復(fù)合物。

4、磁珠結(jié)合與洗滌

加入鏈霉親和素磁珠，這些磁珠能夠與生物素標(biāo)記的RNA結(jié)合。

顛倒混勻，使磁珠與RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物充分接觸并結(jié)合。

通過磁場分離磁珠，去除未結(jié)合的物質(zhì)。

多次洗滌磁珠，以去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。

5、富集蛋白的洗脫

使用適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液洗脫與RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。

6、蛋白質(zhì)檢測與鑒定

SDS-PAGE電泳和銀染色以初步檢測富集到的蛋白質(zhì)。

質(zhì)譜分析或Western blotting等技術(shù)進(jìn)一步鑒定所富集的蛋白質(zhì)。

7、數(shù)據(jù)分析

分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)以確定與RNA相互作用的蛋白質(zhì)種類。

對鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋和網(wǎng)絡(luò)分析，以理解RNA-蛋白質(zhì)相互作用的生物學(xué)意義。

RNA pull down實(shí)驗(yàn)流程

RNA pull down常見問題

1、實(shí)驗(yàn)全程需要注意什么？

實(shí)驗(yàn)使用的所有試劑耗材需經(jīng)過去RNA酶處理，樣本也需要加?蛋白酶和RNA酶抑制劑，最好能夠進(jìn)行超聲處理。裂解蛋白的全程盡量在冰上操作。

2、除了體外轉(zhuǎn)錄，還有別的方式獲取目的RNA嗎？

體外轉(zhuǎn)錄相比化學(xué)合成純度更高，pull-down實(shí)驗(yàn)?般是體外轉(zhuǎn)錄得到目的RNA。但是當(dāng)目的RNA序列大于2000bp時(shí)體外轉(zhuǎn)錄就不太容易轉(zhuǎn)錄成功，這種情況下，我們可以設(shè)計(jì)合成?小段目的RNA探針，通過探針與目的RNA結(jié)合，再與蛋白結(jié)合。

3、RNA體外轉(zhuǎn)錄濃度達(dá)到多少才能用，其OD?般都不高，可以使用嗎？如何定量呢？

通過體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA濃度都能達(dá)到2μg/uL以上，OD值不高可進(jìn)行RNA純化，即便不純化在實(shí)驗(yàn)中多加?些RNA亦可。定量?般會(huì)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以根據(jù)marker濃度來判斷RNA的濃度。也可以用儀器測量RNA的濃度。并且pull-down實(shí)驗(yàn)不需要特別精確的定量，一般都會(huì)加入過量的探針。 

4、lncRNA引物設(shè)計(jì)與普通的引物設(shè)計(jì)有什么區(qū)別？

體外轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增的引物只需要在正向引物5’端加?T7啟動(dòng)子序列即可。 

5、做lncRNApull down+質(zhì)譜?般都會(huì)發(fā)現(xiàn)多個(gè)互作蛋白對嗎？如何選擇哪一種蛋白繼續(xù)研究下去？

不同的RNA結(jié)合蛋白的數(shù)量不等，不能一概而論，根據(jù)自己研究的方向或相關(guān)功能確定篩選蛋白。

凝膠遷移或電泳遷移率(EMSA)

除RIP和RNA pull Down以外，凝膠遷移或電泳遷移率檢測(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)，也稱為凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)或DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)，是一種廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的研究技術(shù)，也可以用于研究蛋白質(zhì)（尤其是轉(zhuǎn)錄因子）與DNA或RNA之間的相互作用。

基本原理

EMSA的基本原理是利用凝膠電泳技術(shù)來觀察蛋白質(zhì)與DNA或RNA形成復(fù)合物后遷移速率的變化。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與標(biāo)記的DNA或RNA片段結(jié)合后，形成的復(fù)合物比未結(jié)合的探針分子更大，因此在電泳過程中遷移速度較慢。通過比較樣品中自由探針與結(jié)合探針的比例，可以推斷出蛋白質(zhì)與核酸的結(jié)合情況。

EMSA基本原理

實(shí)驗(yàn)步驟

準(zhǔn)備樣本：提取細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)或核蛋白。

標(biāo)記探針：使用放射性或非放射性標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記特定的DNA或RNA序列。

蛋白質(zhì)-核酸結(jié)合：將標(biāo)記的探針與待測蛋白質(zhì)混合，允許它們結(jié)合。

凝膠電泳：將混合物進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。

檢測：通過放射自顯影或其他檢測方法（如化學(xué)發(fā)光）來觀察條帶。

EMSA相關(guān)FAQ

1、三種實(shí)驗(yàn)技術(shù)如何選擇？

EMSA主要用于研究RNA與蛋白質(zhì)之間的直接結(jié)合情況，比較傾向于定性分析，通常針對已知RNA研究相應(yīng)蛋白，適用于初步篩選。

RIP更適合研究體內(nèi)條件下特定RNA結(jié)合蛋白與RNA的相互作用。

RNA pull-down是一種直接鑒定與特定RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)的有效方法，適用于體外研究。

選擇哪種方法取決于您的研究目標(biāo)和可用資源。例如，如果您想鑒定特定RNA結(jié)合蛋白與哪些RNA分子相互作用，那么RIP可能是更好的選擇；如果您想研究特定RNA序列與哪些蛋白質(zhì)相互作用，RNA pull-down可能是更合適的選擇。

2、為什么看不到遷移帶？

樣本中的蛋白質(zhì)含量不足；標(biāo)記的探針濃度過低；標(biāo)記效率低；蛋白質(zhì)失活，確保蛋白質(zhì)在處理過程中沒有變性或失活，避免反復(fù)凍融，使用新鮮制備的蛋白質(zhì)樣品。曝光或檢測時(shí)間不足；復(fù)合物不穩(wěn)定等因素。

3、實(shí)驗(yàn)背景高是為什么？

蛋白的質(zhì)量不高，雜質(zhì)多；曝光或者成像時(shí)間過長；封閉時(shí)間不足洗滌效果不佳；實(shí)驗(yàn)過程中膜沒有一直處于濕潤狀態(tài)；標(biāo)記探針的濃度過高等因素。

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