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長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的RNA分子，通常不編碼蛋白，而是以RNA的形式在表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化調(diào)控等眾多生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，成為遺傳學(xué)研究熱點(diǎn)。

圖1 LncRNAs作用機(jī)制

一般來(lái)說(shuō)，非編碼RNA功能研究的主線包含3個(gè)主要步驟：

高通量篩選：對(duì)收集的樣本進(jìn)行分組，采用高通量測(cè)序技術(shù)（如RNA-Seq）和相應(yīng)的特異性數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行高通量篩選，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄本編碼潛能進(jìn)行篩選，判斷其是否具有編碼潛能，從而可以判定該轉(zhuǎn)錄本是否為lncRNA。

候選lncRNA的確定：識(shí)別不同樣品（或樣品組）之間顯著差異表達(dá)的基因或lncRNA，以獲取差異表達(dá)的候選RNA。在測(cè)序得到的非編碼RNA中，通常優(yōu)先選擇差異倍數(shù)大、表達(dá)水平高、且與研究方向相關(guān)的。

功能分析與驗(yàn)證：基于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證非編碼RNA的生物學(xué)功能。比如通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR、原位雜交等技術(shù)，驗(yàn)證RNA在特定樣本或條件下的表達(dá)情況。還可以通過(guò)基因敲除/敲減（如使用siRNA、shRNA或CRISPR/Cas9技術(shù)來(lái)降低lncRNA的表達(dá)水平）或者過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)（如通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體提高lncRNA的表達(dá)水平）等觀察表型變化。要想進(jìn)行深層次的挖掘，可以研究其作用機(jī)制，RNA pull down、RIP、雙熒光素酶等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，檢測(cè)與目標(biāo)RNA相互作用的蛋白質(zhì)或RNA，進(jìn)一步揭示RNA的生物學(xué)功能。然后在動(dòng)物或細(xì)胞模型中驗(yàn)證RNA的功能和調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步確認(rèn)其在生理和病理?xiàng)l件下的重要性。

圖2 LncRNA研究思路

深入了解LncRNA作用機(jī)制能夠幫助我們識(shí)別疾病的潛在機(jī)制，以便尋找新的治療靶點(diǎn)。特別是在藥物研發(fā)中，許多藥物是通過(guò)干擾特定的RNA-蛋白質(zhì)相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)其治療效果的。

RIP和RNA pull-down等實(shí)驗(yàn)技術(shù)是我們深入研究RNA和蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)鍵工具。RIP運(yùn)用目標(biāo)蛋白的特異性抗體分離純化與蛋白相互作用的RNA，RNA pull-down通過(guò)RNA探針捕獲與之相互作用蛋白質(zhì)。今天帶大家了解一下RIP技術(shù)，具體情況如下：

RIP技術(shù)（RNA Binding Protein lmmunoprecipitation，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀），是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)，是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)過(guò)程的有力工具。該技術(shù)主要是運(yùn)用目標(biāo)蛋白的特異性抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來(lái)，然后經(jīng)過(guò)分離純化對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行q-PCR驗(yàn)證或高通量測(cè)序分析，主要進(jìn)行已知蛋白與已知RNA互作QPCR驗(yàn)證、已知蛋白與未知RNA互作二代測(cè)序篩選等。

圖3 RIP技術(shù)原理

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圖4 abs50071 RNA免疫共沉淀(RIP)試劑盒IP后WB驗(yàn)證圖

常見(jiàn)問(wèn)題：

1、RIP可以分提核漿的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物嗎？

理論上，可以采用能分別抽提核漿蛋白的蛋白抽提kit先分離樣本，再進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)。但是所用kit中的試劑組分不能有RNase和DNase，以及要能與下游的抗體beads孵育兼容。

2、樣本中拉下的RNA濃度過(guò)低，如何改善？

可能的原因有：樣本量過(guò)少，考慮增加樣本初始量，另一個(gè)是裂解不充分，組織樣本未研磨充分等原因。

3、溶解曲線異常

出現(xiàn)非特異擴(kuò)增或有引物二聚體等情況，需重新設(shè)計(jì)引物。

4、IP和IgG樣本Ct值沒(méi)有什么差異，是什么原因造成的？

可能由于抗體沒(méi)有富集到RNA，可更換抗體嘗試；或者IgG背景過(guò)高，可增加洗滌次數(shù)或減少免疫沉淀步驟RNA投入量。

5、如何判斷RIP實(shí)驗(yàn)是否成功？

RIP后WB檢測(cè)IP組和input組檢測(cè)到目的蛋白信號(hào)即判斷RIP實(shí)驗(yàn)成功。

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