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背景介紹

隨著腫瘤的急劇生長(zhǎng)，其內(nèi)部血液供應(yīng)嚴(yán)重不足，導(dǎo)致氧氣的輸送受到很大程度的抑制，最終使得腫瘤內(nèi)微環(huán)境明顯乏氧。因此，乏氧是晚期實(shí)體腫瘤的一個(gè)重要環(huán)境特征，不僅會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，同時(shí)也是腫瘤治療過程中的主要障礙之一。因此，調(diào)節(jié)腫瘤部位乏氧狀態(tài)被認(rèn)為是一種改善癌癥治療效果的有效策略（圖1）。

圖1 腫瘤血管常態(tài)化。腫瘤血管(左)和正常血管(右)

腫瘤乏氧標(biāo)志物

乏氧與腫瘤細(xì)胞內(nèi)生物還原酶的活性密切相關(guān)，多種生物還原酶通常會(huì)過度表達(dá)。此外，乏氧通常也會(huì)導(dǎo)致腫瘤其他微環(huán)境參數(shù)發(fā)生變化，如pH值降低、間質(zhì)流體壓力升高、糖酵解和還原能力增強(qiáng)等。

分子探針能對(duì)乏氧進(jìn)行可視化檢測(cè)，有望實(shí)現(xiàn)乏氧腫瘤的準(zhǔn)確影像。目前，可激活腫瘤乏氧分子探針的物質(zhì)包括基于硝基還原酶 (Nitroreductase，NTR)、基于偶氮還原酶 (Azoreductase) 和基于氫醌還原酶 (Quinone Oxidoreductase，hNQO1) 的乏氧分子探針（圖2）。

圖2 腫瘤乏氧相關(guān)標(biāo)志物^[1]

腫瘤乏氧緩解策略

近年來，眾多學(xué)者嘗試以新型納米生物材料為載體將分子氧輸送到腫瘤組織或催化氧氣原位生成，以提高腫瘤治療療效。根據(jù)腫瘤部位氧氣補(bǔ)充方式，李從虎等^[2]提出3種基于納米材料緩解腫瘤乏氧的策略：①腫瘤微環(huán)境的重塑（內(nèi)源氧補(bǔ)充）；②納米氧載體靶向遞送（外源氧輸送）；③原位氧氣催化再生。

例如腫瘤微環(huán)境的重塑主要是3種設(shè)計(jì)思路：利用納米載體輸送抗血管生成藥物，使腫瘤血管正?；?；利用具有光熱效應(yīng)的納米材料進(jìn)行光熱治療；利用納米載體輸送蛋白酶類物質(zhì)，破壞腫瘤組織處的ECM，使血管舒張，增加腫瘤的血流灌注。如CONG等^[3]預(yù)先在小鼠瘤內(nèi)注射透明質(zhì)酸酶 (hyaluronidase，HAase)，隨后尾靜脈注射光敏劑二氫卟吩e6 (chlorine e6，Ce6) 偶聯(lián)的納米粒 (NM-Ce6)，結(jié)果顯示HAase可有效分解腫瘤處致密的HA，增加腫瘤血管密度，促進(jìn)氧氣的擴(kuò)散和粒子的滲透。

細(xì)胞缺氧檢測(cè)試劑盒

Absin公司熱賣生化試劑—熒光探針與染料系列，新上兩種探針試劑盒：細(xì)胞缺氧檢測(cè)試劑盒-紅色熒光和細(xì)胞缺氧檢測(cè)試劑盒-綠色熒光，助力廣大科研學(xué)者在細(xì)胞缺氧方面的研究工作。下面小愛以細(xì)胞缺氧檢測(cè)試劑盒-紅色熒光為例，詳細(xì)介紹該試劑盒的使用方法。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

細(xì)胞缺氧檢測(cè)試劑盒是一種利用紅色熒光探針進(jìn)行細(xì)胞缺氧狀態(tài)檢測(cè)的試劑盒。O92熒光探針可自由透過活細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并與細(xì)胞內(nèi)的缺氧損傷產(chǎn)物反應(yīng)，形成紅色熒光產(chǎn)物，產(chǎn)生紅色熒光。紅色熒光隨著缺氧程度的增加而增強(qiáng)。因此，根據(jù)活細(xì)胞中紅色熒光的產(chǎn)生，可以判斷細(xì)胞缺氧的變化。

O92在激發(fā)波長(zhǎng)536nm，發(fā)射波長(zhǎng)580nm附近，使用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀等檢測(cè)熒光，從而測(cè)定細(xì)胞內(nèi)缺氧狀況。

適用范圍：

本試劑盒可以用于各種真核培養(yǎng)細(xì)胞、培養(yǎng)或灌流組織及新鮮組織振動(dòng)切片以及冰凍切片的檢測(cè)。

試劑盒特點(diǎn)：

1、使用方便：可用激光共聚焦顯微鏡直接觀察、熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)；

2、背景低，靈敏度高；

3、線性范圍寬，使用方便。

使用方法：

儀器：熒光顯微鏡/流式細(xì)胞儀/激光共聚焦/熒光酶標(biāo)儀、離心機(jī)、移液器、冰箱、冰盒；

試劑：PBS緩沖液或者HBSS；

耗材：黑色透明底熒光專用96孔培養(yǎng)板、離心管、吸頭、一次性手套；

O92探針標(biāo)記：

1、O92溶液可在新鮮無血清培養(yǎng)液、PBS、HBSS、HEPES等緩沖鹽溶液中稀釋到所需濃度，100-1000倍稀釋，以此染色液更換細(xì)胞培養(yǎng)液；也可直接向細(xì)胞孵育液體中加入O92探針溶液至所需濃度。
2、依據(jù)細(xì)胞缺氧程度的不同，O92終濃度可選擇在100-1000倍稀釋的范圍，孵育時(shí)間可選擇60-120min，在37℃進(jìn)行避光孵育。
3、孵育結(jié)束后，用新鮮溶液清洗細(xì)胞。
4、檢測(cè)細(xì)胞熒光。

共聚焦/熒光顯微鏡檢測(cè)：

對(duì)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞或活組織，可直接在熒光顯微鏡下觀察；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，取25-50μL細(xì)胞懸液滴到一張顯微載玻片上，再蓋上一張蓋玻片。

熒光顯微鏡下，用藍(lán)光或綠光激發(fā)，觀察和拍攝細(xì)胞紅色發(fā)射圖像，缺氧細(xì)胞被染成紅色。

流式細(xì)胞儀分析：

對(duì)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，用胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，直接收集細(xì)胞。用0.5~1mL冷PBS重懸細(xì)胞（5~10萬）。采用480~536nm波長(zhǎng)激發(fā)，測(cè)定580nm~610nm的發(fā)射。

陰性細(xì)胞僅有較低的熒光強(qiáng)度，缺氧細(xì)胞有較強(qiáng)的紅色熒光。

[1] 陳華, 覃君霞, 譚必穗等. 腫瘤乏氧分子探針的研究進(jìn)展[J].廣西科學(xué), 2023, 30(4):625-633.
[2] 李從虎, 馮夢(mèng)夢(mèng), 楊妞妞等. 納米生物材料在腫瘤乏氧緩解策略中的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2023.
[3] GONG H, CHAO Y, XIANG J, et al. Hyaluronidase to enhance nanoparticle-based photodynamic tumor therapy [J]. Nano Lett, 2016, 16(4): 2512-2521．

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