2型糖尿病(T2D)是一種全球性威脅，影響著全球數(shù)百萬人。T2D是心肌梗死的一個重要風險因素，導致心肌血運重建后嚴重的左心室功能障礙，增加缺血-再灌注(I/R)損傷的風險，并使疾病發(fā)展復雜化。糖尿病心肌損傷加重的原因尚待闡明，線粒體功能損傷一直是研究的焦點。
有研究表明T2D增加心肌缺血-再灌注(MI/R)損傷易感性的機制包括：①T2D本身觸發(fā)高血糖和胰島素抵抗；②在缺血和再灌注期間誘導的氧化應激和炎癥的釋放。這兩者都導致線粒體功能障礙。盡管越來越多的證據(jù)表明線粒體功能障礙與其在T2D MI/R病理生理學中的作用有關，但通過靶向線粒體來對抗這種疾病的有效治療策略尚未實施。
圖1 糖尿病MI/R損傷發(fā)病機制研究圖形摘要[1]
2023年8月3日，武漢大學人民醫(yī)院夏中元教授團隊在Cell Communication and Signaling上發(fā)表題為“Decreased MFN2 activates the cGAS-STING pathway in diabetic myocardial ischaemia-reperfusion by triggering the release of mitochondrial DNA"的研究論文。他們采用高脂飲食(HFD)加小劑量鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病小鼠模型，心肌缺血2h再灌流30min建立MI/R模型，高糖(HG)和棕櫚酸(PA)誘導H9C2細胞糖脂毒性的細胞模型。研究闡明了cGAS-STING激活在糖尿病MI/R損傷的發(fā)病機制中的關鍵作用，該激活是由線粒體融合減少引起的胞漿線粒體DNA增加所觸發(fā)的。
圖2 rAAV-MFN2過表達調控糖尿病MI/R小鼠線粒體動力學和功能。C：線粒體形態(tài)變化；E-H：心肌細胞總ATP生成量及COX Ⅰ、COX Ⅱ、COX Ⅴ活性[1]。
夏中元教授團隊的研究結論為糖尿病MI/R損傷的治療提供了臨床前的見解。研究中，心肌細胞總ATP的檢測與定量使用了愛必信（上海）生物科技有限公司提供的ATP Microplate Assay Kit。
ATP檢測試劑盒(abs580117)使用方法介紹
適用范圍：尿液、血清、血漿、組織提取物、細胞裂解物、細胞培養(yǎng)上清和其他生物液體樣品
檢測原理：
三磷酸腺苷(ATP)是細胞代謝的化學能，通常被稱為細胞的“能量貨幣"。ATP只在光合作用和細胞呼吸過程中產生，并在生物合成反應、運動和細胞分裂等細胞過程中消耗。它是細胞活動的關鍵指標，在研究和藥物開發(fā)中被用作衡量細胞活性和細胞毒性的指標。
ATP檢測試劑盒是一種靈敏的測定各種樣品中三磷酸腺苷的方法。三磷酸腺苷濃度由肌酸激酶和肌酸決定。反應產物可以在660nm的比色讀數(shù)下測量。
試劑盒組分 | 規(guī)格 | 儲存條件 |
96-Well Microplate | 1 plate | — |
Assay Buffer | 30mL × 4 | 4 ℃ |
Enzyme | Powder × 1 | -20 ℃，keep in dark |
Reaction Buffer | 1mL × 1 | 4 ℃ |
Substrate | Powder × 1 | -20 ℃，keep in dark |
Dye Reagent Ⅰ | Powder × 1 | 4 ℃ |
Dye Reagent Ⅱ | Powder × 1 | 4 ℃ |
Dye Reagent Ⅲ | 10mL × 1 | 4 ℃ |
Standard | Powder × 1 | -20℃ |
Plate Adhesive Strips | 3 Strips | — |
Technical Manual | 1 Manual | — |
備注：
1、反應后溶液應呈現(xiàn)黃色。如果沒有顏色，說明實驗失敗。如果呈藍色，則說明溶液受到污染。為了防止磷污染，最好使用一次性塑料容器來配制溶液。
2、Enzyme：使用前加入1mL蒸餾水溶解。
3、Substrate：使用前加入6mL蒸餾水并加熱至溶解。
4、Standard：使用前加入1mL蒸餾水充分溶解，然后取500μL加入500μL蒸餾水中，獲得濃度為5mmol/L的標準溶液。
5、Dye Reagent Working Solution：分別取5mL Dye Reagent Ⅲ加入到Dye Reagent Ⅰ中，1mL Dye Reagent Ⅲ加入到Dye Reagent Ⅱ中充分溶解。將所有Dye Reagent Ⅱ轉移到Dye Reagent Ⅲ中充分混合，然后將所有Dye Reagent Ⅰ轉移到Dye Reagent Ⅲ中（必須遵循這一步驟）?；旌系娜玖显噭┛稍?℃保存2-3天。
實驗步驟：
一、試劑和材料
1、自備試劑：蒸餾水
2、自備材料：酶標儀、移液器與槍頭、離心管、離心機、計時器、濕冰等。
二、樣品處理
1、細胞/細菌樣品：將細胞或細菌（5×106個）收集到離心管中，離心后去掉上清液，加入1mLAssay buffer，超聲處理（功率20%，超聲3s，間隔10s，重復30次），在4℃、8000g下離心10min，將上清液轉移至新的離心管中，置于濕冰上待檢測；
2、組織樣品：稱取1g組織，加入1mL Assay Buffer進行超聲勻漿（功率20%，超聲3s，間隔10s，重復30次）后，在4℃、8000g下離心10min，將上清液轉移至新的離心管中，置于濕冰上待檢測；
3、血清/血漿樣品：直接置于濕冰上待檢測。
三、標準曲線制備
用蒸餾水對試劑盒提供的標準品（2.5mmol/L）進行2倍連續(xù)稀釋，形成標準曲線。
四、樣品預實驗
對于未知的樣品，濃度可能在很大的范圍內變化。建議多做幾個稀釋梯度進行預實驗，以確保讀數(shù)在標準曲線范圍內。
五、樣品檢測
使用前將所有試劑加熱至37℃。按照以下方式加樣并充分反應，最后用酶標儀在660nm下檢測吸光值。
試劑 | 樣品孔 | 標準品孔 | 空白孔 |
樣品 | 20μL | — | — |
標準品 | — | 20μL | — |
蒸餾水 | — | — | 20μL |
Substrate | 60μL | 60μL | 60μL |
Reaction Buffer | 10μL | 10μL | 10μL |
Enzyme | 10μL | 10μL | 10μL |
混合均勻，放入37°C烘箱中孵育30min。 | |||
Dye Reagent Working Solution | 100μL | 100μL | 100μL |
混合均勻，室溫孵育10min后在660nm處檢測吸光值。 | |||
六、樣品濃度計算
樣品濃度計算試劑盒說明書中提供兩種計算方式：①標準曲線法；②公式法。
針對說明書既有計算公式又有標曲的試劑盒，兩種方式任選一種就可以，公式是簡便算法。建議按照標曲計算，雖然比較麻煩且耗費試劑，但檢測結果會更加準確。按照標曲計算，每一次都需要重新做標曲，因為這種反應是一個變化的過程，檢測的數(shù)值會隨著反應時間、溫度等產生變化。
圖3 ATP檢測標準曲線示例（檢測限：0.02mmol/L - 2.5mmol/L）
常見問題解答
Q1：我的樣本是組織，按照說明書提供的樣品處理方法收集上清進行檢測，如何確認上清稀釋倍數(shù)？
A1：由于待測樣品的ATP含量未知，建議選取合適的樣品點（2-3個）做預實驗以確定稀釋倍數(shù)。
Q2：說明書中提到混合后的染料試劑可在4℃ 保存2-3天，我要在2-3天內把實驗做完嗎？
A2：試劑盒中染料(Dye)溶解后易氧化變質，長時間儲存會失效。建議老師多攢些樣品一次性檢測；如必須分次檢測，可以考慮單買組分。
Q3：ATP檢測試劑盒里面的檢測板可以拆分嗎？因為如果要做預實驗摸索稀釋倍數(shù)的話，可能只做幾個孔。
A3：板子不能拆分，但是可以用常規(guī)的96孔酶標板替代做預實驗。
ATP檢測試劑盒引用文獻
[1] Xiong Y, Leng Y, Tian H, et al. Decreased MFN2 activates the cGAS-STING pathway in diabetic myocardial ischaemia-reperfusion by triggering the release of mitochondrial DNA[J]. Molecular biology reports, Cell Communication and Signaling, 2023,21:192.
[2] Xu J, Xiong A, Wang X,et al.Hyperoside attenuates pyrrolizidine alkaloids-induced liver injury by ameliorating TFEB-mediated mitochondrial dysfunction[J]. Archives of Pharmacal Research, 2023, 46(8):694-712.
[3] CaoM J, Huang X W, Zou J L, et al. Attenuation of Microglial Activation and Pyroptosis by Inhibition of P2X7 Pathway Promotes Photoreceptor Survival in Experimental Retinal Detachment[J]. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2023, 64(7):1-14.
[4] YeB, Pei Y T, Wang L J, et al. NAD+ supplementation prevents STING-induced senescence in CD8+ T cells by improving mitochondrial homeostasis[J]. Journal of Cellular Biochemistry, 2024,1-17.
ATP系列試劑盒推薦：
貨號 | 產品名稱 | 規(guī)格 | 檢測范圍 |
abs580117 | ATP Microplate Assay Kit | 96T | 0.02mmol/L - 2.5mmol/L |
abs580019 | Na+/K+ ATPase Microplate Assay Kit | 96T | 0.01μmol/L - 5μmol/L |
abs580020 | Ca2+/Mg2+ ATPase Microplate Assay Kit | 96T | 0.01μmol/L - 5μmol/L |
其他生化檢測試劑盒推薦：
貨號 | 產品名稱 | 規(guī)格 | 檢測范圍 |
abs580002 | 谷丙轉氨酶(ALT)檢測試劑盒 | 96T | 0.625μmol/mL - 20μmol/mL |
abs580004 | 谷草轉氨酶(AST)檢測試劑盒 | 96T | 0.625μmol/mL - 20μmol/mL |
abs580006 | 谷胱甘肽檢測試劑盒 | 96T | 0.01mmol/L - 0.5mmol/L |
abs580066 | 羥脯氨酸檢測試劑盒 | 96T | 2μmol/L - 200μmol/L |
abs580072 | 己糖激酶檢測試劑盒 | 96T | 4μmol/L - 400μmol/L |
abs580073 | 丙酮酸激酶檢測試劑盒 | 96T | 4μmol/L - 400μmol/L |
abs580074 | 磷酸果糖激酶檢測試劑盒 | 96T | 4μmol/L - 400μmol/L |
abs580085 | 甘油三酯(TG)檢測試劑盒 | 96T | 0.1mmol/L - 5mmol/L |
abs580107 | 磷離子檢測試劑盒 | 96T | 0.01mmol/L - 0.4mmol/L |
abs580111 | 血紅蛋白檢測試劑盒 | 96T | 1μg/mL - 100μg/mL |
abs580119 | α酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)檢測試劑盒 | 96T | 4μmol/L - 400μmol/L |
abs580140 | 銅離子檢測試劑盒 | 96T | 1μmol/L - 250μmol/L |
abs580156 | 異檸檬酸脫氫酶檢測試劑盒 | 96T | 0.2mmol/L - 20mmol/L |
abs580197 | 尿素氮(BUN)檢測試劑盒 | 96T | 0.05mmol/L - 1mmol/L |
abs580199 | 肌酐檢測試劑盒 | 96T | 0.05 mmol/L - 5 mmol/L |
abs580222 | ?；撬釞z測試劑盒 | 96T | 0.1mmol/L - 10mmol/L |
abs580226 | 輔酶Q10檢測試劑盒 | 96T | 0.1mmol/L - 10mmol/L |
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