全血：使用肝素鈉抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素鋰、EDTA和ACD抗凝劑，血樣在8小時(shí)內(nèi)分析，超過8小時(shí)會(huì)導(dǎo)致活性的損失，一般細(xì)胞因子陽性細(xì)胞會(huì)減少5%。如不能在8小時(shí)之內(nèi)檢測，應(yīng)將真空采血管水平室溫放置。
 
自身血漿中外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)：使用肝素鈉抗凝的采血后，分離PBMCs，24小時(shí)內(nèi)分析。
 
組織培養(yǎng)基中的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)：用Ficoll分離PBMCs，將細(xì)胞重懸于含10%熱滅活胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×106細(xì)胞/ml。
 
調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度2×106細(xì)胞/mL于新鮮培養(yǎng)基中。
 
冰凍全血與PBMCs：使用1×紅細(xì)胞裂解液處理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重懸，-70℃凍存。溶化后細(xì)胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，離心5分鐘后，用破膜劑對細(xì)胞進(jìn)行破膜和染色。
 
所需試劑
 
1、細(xì)胞表面染色的熒光標(biāo)記的單抗試劑
 
依據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇特殊表面標(biāo)志
 
CD45圈定所有淋巴細(xì)胞
 
CD3 圈定T淋巴細(xì)胞
 
CD4 圈定T輔助淋巴細(xì)胞亞群
 
CD8 圈定T抑制淋巴細(xì)胞亞群
 
CD19/或CD20圈定B淋巴細(xì)胞
 
CD56圈定NK淋巴細(xì)胞
 
CD14圈定單核細(xì)胞
 
2、熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體
 
R&D提供FITC、PE和APC標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體
 
3、溶血素
 
用外周全血檢測時(shí)需使用溶血素(R&D目錄號WL1000用于人或者WL2000用于小鼠;eBioscience目錄號00-4333)溶解紅細(xì)胞
 
4、激活劑
 
① Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)(Alexis，目錄號ALX-445-004-M001)
 
DMSO中調(diào)節(jié)濃度0.1mg/mL
 
分裝(20?L)，-20℃儲(chǔ)存。勿反復(fù)凍融
 
每次實(shí)驗(yàn)用無菌無疊氮鈉PBS 1：100稀釋儲(chǔ)存液
 
D.PMA終濃度25ng/mL細(xì)胞懸液
 
② Ionomycin (Alexis，目錄號ALX-450-006-M001)
 
于乙醇中配制成濃度0.5mg/mL
 
-20℃儲(chǔ)存
 
每次實(shí)驗(yàn)用無菌無疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲(chǔ)存液
 
③Ionomycin終濃度1?g/mL細(xì)胞懸液
 
Staphylococcal enterotoxin B(SEB) (Sigma，Catalog No.S-4881)
 
無菌無疊氮鈉PBS調(diào)節(jié)濃度0.5mg/mL
 
4℃儲(chǔ)存
 
SEB終濃度10?g/mL細(xì)胞懸液
 
④ CD3：包被在培養(yǎng)板中，在蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑存在下活化未稀釋的血液細(xì)胞
 
⑤ CD28：加速不同刺激劑(包括SEB、CD3等)的活化效應(yīng)，濃度一般為10ug/ml
 
5、阻斷劑
 
阻斷高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)作用，使得刺激細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子聚集在胞漿內(nèi)
 
① Brefeldin-A(BFA) (eBioscience，目錄號00-4506)
 
于DMSO中調(diào)節(jié)濃度5mg/mL
 
分裝(20L)，-20℃儲(chǔ)存。勿反復(fù)凍融。
 
每次實(shí)驗(yàn)用無菌無疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲(chǔ)存液
 
激活zui后4-5小時(shí)BFA終濃度10?g/mL細(xì)胞懸液。
 
注意：BFA過度孵育會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力下降
 
② Monensin (eBioscience，目錄號00-4505)
 
6、 不含谷氨酰胺的RPMI-1640