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食品中赭曲霉毒素A的測(cè)定
由赭曲霉(Aspergiltus Ochratoxin)和硫色曲霉(A.sulphureus)等產(chǎn)生的赭曲霉毒素(Ochratoxin)有A、B、C、D 四種化合物。其中，赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是重具衛(wèi)生學(xué)意義的霉菌代謝產(chǎn)物。赭曲霉毒素A 是一種強(qiáng)致死性化合物，它會(huì)導(dǎo)致肝、腎壞死性病變。對(duì)雛鴨經(jīng)口測(cè)試， LD50 僅為0.5mg/kg體重，其毒性與黃曲霉素相當(dāng)。在肝癌高發(fā)區(qū)的谷物中可分離出赭曲霉素。赭曲霉素A 的污染范圍較廣，幾乎可污染玉米，小麥等所有的谷物和中藥材。
目前已有糧食和食品中赭曲霉毒素A 的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。本文以薏苡仁、淡豆豉和白扁豆為基質(zhì)，發(fā)展赭曲霉毒素A 的前處理和分離檢測(cè)方法，以期對(duì)同類型的檢測(cè)提供參考。
樣品前處理
提取液
甲醇：水 (8:2, v:v)。
PBS 溶液
稱取8 g 氯化鈉、1.2 g 磷酸氫二鈉、0.2 g 磷酸二氫鉀，溶解于990 mL 水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH 7，用水稀釋至1 L。
清洗液緩沖
稱取25 g 氯化鈉、5 g 碳酸氫鈉溶于水中，加入0.1 mL 吐溫-20，用水稀釋至1 L。稱取15 g 中藥樣品加入到50 mL 離心管中，加入30 mL 提取液，加入0.75 g氯化鈉，振搖后渦旋3 min，超聲20 min，中間振搖3 次，11000 r/min 離心15 min后取上清液。取2 mL 上清液, 氮吹除去大部分的甲醇后，用PBS 溶液定容到10mL，過(guò)0.22 um 濾膜。取過(guò)濾后的提取液5 mL，以1 滴每3 秒流速流過(guò)免疫親和柱，然后2~4 mL 空氣排空，10 mL 清洗緩沖液、10 mL 水依次淋洗免疫親和柱，棄去淋洗液，抽干小柱。1.5 mL 甲醇洗脫，40 ℃下氮?dú)獯蹈桑昧鲃?dòng)相定容至1 mL，供檢測(cè)。
測(cè)試用對(duì)照品的配制
使用流動(dòng)相將10 mg/L 的赭曲霉毒素A 標(biāo)準(zhǔn)溶液依次稀釋成3.13 μg/L、6.25μg/L、12.50 μg/L、25.00 μg/L、50.00 μg/L、100.00 μg/L 和200.00 μg/L 的線性標(biāo)準(zhǔn)溶液。
色譜條件
色譜柱（貨號(hào)）:Acclaim C18
4.6×150 mm,5 μm(貨號(hào)：059148)
流動(dòng)相：乙腈：水：冰醋酸 (48:51:1, v:v:v)
流速：1mL/min
檢測(cè)器：熒光，Ex: 333nm；Em: 460nm
柱溫：30℃
進(jìn)樣量：20μL
儀器：Ultimate 3000
實(shí)驗(yàn)譜圖
1
線性
圖1 線性疊加譜圖（從低到高依次代表濃度為3.13 μg/L、6.25 μg/L、12.50 μg/L、25.00 μg/L、50.00μg/L、100.00 μg/L 和200.00 μg/L 的OTA 標(biāo)準(zhǔn)溶液）
圖2 OTA 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
表1 赭曲霉毒素A 線性曲線
名稱 線性曲線
OTA A = 6166C + 12898，R² = 1.000
2
重復(fù)性
圖3 低濃度樣品(3.13 μg/L OTA)重復(fù)性
表2 低濃度樣品進(jìn)樣重復(fù)性
名稱 保留時(shí)間 RSD% 峰面積 RSD% 樣品濃度（μg/L）
OTA 0.09% 0.67 % 3.13
圖4 高濃度樣品(200 μg/L OTA)重復(fù)性
表3 高濃度樣品進(jìn)樣重復(fù)性
名稱 保留時(shí)間 RSD% 峰面積 RSD% 樣品濃度（μg/L）
OTA 0.01% 0.11% 200
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
檢出限和定量限
圖5 檢出限 (0.15 μg/L OTA)譜圖與空白疊加譜圖
圖6 定量限 (0.55 μg/L OTA)譜圖與空白疊加譜圖
表4 赭曲霉毒素A 的LOD 和LOQ
名稱 保留時(shí)間（min）
LOD(S/N=3)
(μg/L)
LOQ(S/N=10)
(μg/L)
OTA 9.05 0.15 0.55
回收率
圖7 薏苡仁加標(biāo)回收
1- 薏苡仁樣品加標(biāo)； 2-赭曲霉毒素A 對(duì)照品； 3-薏苡仁樣品
圖8 淡豆豉加標(biāo)回收
1-淡豆豉樣品加標(biāo)； 2-赭曲霉毒素A 對(duì)照品； 3 淡豆豉樣品
圖9 白扁豆加標(biāo)回收
1-白扁豆樣品加標(biāo)； 2-赭曲霉毒素A 對(duì)照品； 3-白扁豆樣品
表5 回收率數(shù)據(jù)
名稱 加標(biāo)量（μg/L） 加標(biāo)回收率（%）
薏苡米 2.5 99.8
淡豆豉 2.5 100.2
白扁豆 2.5 97.4
結(jié)論
本文參考《SNT 1940-2007 進(jìn)出口食品中赭曲霉毒素A 的測(cè)定方法》、《SNT1746-2006 進(jìn)出口大豆、油菜籽和食用植物油中赭曲霉毒素A 的檢驗(yàn)方法》和《方法報(bào)告-2013-APP-RLC-058-免疫親和液相熒光法測(cè)定飼料中的赭曲霉毒素A》發(fā)展赭曲霉毒素A 測(cè)定的方法。以赭曲霉毒素A 對(duì)照品為樣品，考察了液相方法的檢測(cè)限、檢出限和線性范圍。以薏苡仁、白扁豆和淡豆豉為基質(zhì)，考察了前處理方法的凈化能力和基質(zhì)干擾情況。結(jié)果表明，該前處理方法回收率高、具有較好的凈化能力，赭曲霉毒素A 出峰位置附近無(wú)干擾峰，可用于薏苡仁、白扁豆和淡豆豉赭曲霉毒素A 的檢測(cè)。液相方法重復(fù)性好、具有較寬的線性范圍、較低的檢測(cè)限和檢出限。