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文章標(biāo)題《氧化葡萄糖酸桿菌合成吡咯喹啉醌的研究》

文章中引用我司試劑三辛胺

文章詳細(xì)內(nèi)容如下：

吡咯喹啉醌是繼煙酰胺、核黃素輔酶之后第三類輔酶,為B族維生素新成員,具有重要的生理功能,因此,大規(guī)模制備吡咯喹啉醌具有重要的意義。由于化學(xué)合成步驟多、產(chǎn)率低、異構(gòu)體和副產(chǎn)品的去除需要多步純化,且重金屬催化劑不利于環(huán)境,生物合成吡咯喹啉醌是目前大規(guī)模制備的途徑,為此,本課題主要研究了氧化葡糖桿菌合成吡咯喹啉醌的發(fā)酵條件、分離純化及酶法合成的分子基礎(chǔ),具體如下:1、氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵制備P的條件研究用單因素試驗和正交試驗的方法對氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明,氧化葡糖桿菌發(fā)酵制備P的培養(yǎng)基成分*添加量為谷氨酸4g/L,酪氨酸4g/L,FeSO4?7H2O 5mg/L,此時合成Pzui多為0.813ml/L,與理論預(yù)測值基本吻合。運用單因素分析方法進(jìn)行了氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化,結(jié)果表明,pH值為6.5,發(fā)酵溫度為28℃,發(fā)酵轉(zhuǎn)速為200 r/min為*發(fā)酵條件。2、氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵液中P的分離純化研究P的結(jié)構(gòu)中包含3個羧基,顯色酸性。根據(jù)這個結(jié)構(gòu)特點,采用絡(luò)合萃取法對其進(jìn)行分離純化,發(fā)酵液經(jīng)高速離心,將上清液在雙溶質(zhì)萃取體系進(jìn)行絡(luò)合萃取,其中三辛胺為絡(luò)合劑,正己烷為稀釋劑,得到富含吡咯喹啉醌的上層液,再用氨水反萃,減壓濃縮后冷凍干燥,得到單一產(chǎn)物。經(jīng)HPLC檢測純度可達(dá)到90%以上。該方法條件簡單、過程快捷、便于大規(guī)模工業(yè)化生物試劑。3、氧化葡萄糖酸桿菌P合成基因簇的克隆與表達(dá)及酶法合成研究經(jīng)過菌體發(fā)酵生物試劑P的嘗試,我們進(jìn)一步用單純且可控的無細(xì)胞體系合成吡咯喹啉醌。LC-MS結(jié)果顯示,P是可以體外合成的,它的前體是多肽PA。在各種酶的作用下,PA經(jīng)歷了一系列變化zui終生成P,但是各種酶反應(yīng)機制目前尚不清楚,有待進(jìn)一步研究。為此,我們克隆和表達(dá)了氧化葡糖桿菌合成P的基因簇各種酶的基因,并通過His-標(biāo)簽鎳離子分離柱對粗蛋白進(jìn)行純化與濃縮,獲得了重組菌種、重組質(zhì)粒及酶等生物材料,嘗試了酶法合成吡咯喹啉醌,該研究尚未取得結(jié)果。綜合以上,通過本課題的研究獲得了吡咯喹啉醌快速檢測技術(shù)、發(fā)酵優(yōu)化條件、快速分離純化方法、以及合成P基因重組質(zhì)粒及酶蛋白,為研究吡咯喹啉醌的酶法合成打下堅實的基礎(chǔ)。因此,本課題具有重要的理論價值和實際生物試劑價值。

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