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想做好血液RNA-seq實驗？這些經(jīng)驗請收好！
閱讀：693發(fā)布時間：2024-12-20
血液是一種信息量巨大、獲取方便且微創(chuàng)的樣本類型，廣泛用于診斷和臨床研究，以探索疾病的病理和生理機制以及療法的作用。全血轉錄組測序是一種基于RNA測序（RNA-Seq）的方法，可對全血進行深入的基因表達譜分析，深入了解全系統(tǒng)范圍內所有轉錄本的表達和豐度。高通量RNA-Seq技術的發(fā)展使我們能夠以較低的成本收集高質量的血液轉錄組信息，為發(fā)現(xiàn)生物標志物、了解藥物反應、病理和生理過程以及疾病的無創(chuàng)診斷帶來了革命性的變化。
外周血的優(yōu)勢在于采集快捷，且可在大規(guī)模人群中實現(xiàn)。然而，一旦血液離開人體，問題就來了。傳統(tǒng)方法需要從全血中分離白細胞，再提取RNA，以解決血液中污染物的問題。如今，專門為制備血液樣本而開發(fā)的方案使我們能夠從全血中獲得高質量的RNA-Seq 數(shù)據(jù)。
什么是RNA-seq？
RNA-seq即轉錄組測序技術（Transcriptome sequencing），廣義的定義為：對細胞內所有RNA（包括rRNA/ tRNA/ mRNA等）進行高通量測序，狹義的定義為：對細胞內mRNA進行高通量測序，臨床檢驗實驗室指的一般為狹義的轉錄組測序。
血液樣本
任何血液轉錄組分析實驗的第一步都是通過靜脈穿刺或指針采血。從少量血液中獲取優(yōu)質RNA的技術進步，如通過指針采樣，將使廣泛的研究成為可能，參與者甚至可以進行自我采樣。
血液RNA降解可能發(fā)生在采集、儲存和處理過程中，因此，血液排出體外后，必須防止或減少RNA降解。而血液RNA極易降解的原因之一是血漿中含有高濃度的RNA酶（RNase）。在一項研究中，血漿內的游離RNA僅在15 秒鐘就發(fā)生降解，導致無法進行實時PCR擴增，RNA酶的威力由此可見一斑。因此，在采集全血時立即抑制RNA酶的活性至關重要，這樣才能確保采集高質量的RNA，這對下游測序、生物標記物鑒定和疾病診斷至關重要。
為了降低RNA的降解，特別是在開展大規(guī)模血液轉錄組學項目時，我們建議使用專門RNA采血管收集血液，如PAXgene™全血RNA 采血管（BD, 762165）。該采血管含有能穩(wěn)定 RNA 的專有試劑，能產(chǎn)生準確反映采樣時血液狀態(tài)的基因表達數(shù)據(jù)。
更重要的一點，采血管的樣本儲藏時間及RNA質量的穩(wěn)定性，是大型多中心臨床研究的一個關鍵考慮因素。PAXgene全血RNA保存管（762165）內含能夠穩(wěn)定體內基因轉錄性狀的抗凝劑?？鼓齽┠軌驕p少RNA在體外的降解，穩(wěn)定細胞內的RNA，并將基因誘導的水平降低到最小程度，被廣泛用于血液RNA樣本的保存。相關實驗證明，PAXgene™ 全血RNA 采血管中樣本在-80℃儲存7年后 ，提取的RNA 質量與產(chǎn)量均較穩(wěn)定，樣本在-20℃中儲存11年后，RNA 質量與采集當天相比沒有降低。
PAXgene™ 血液RNA管附帶有配套的RNA提取方案（Qiagen，cat.762331），也可以使用不同的RNA提取方案進行分離，例如使用苯酚/氯仿提取，或與血液樣本兼容的其他方案。
細胞壁被破壞后，裂解液中不僅含有RNA，還含有DNA和蛋白質?；蚪MDNA（gDNA）是"雜質"之一，會在數(shù)據(jù)分析步驟中造成偏差和定量問題。然而，由于血細胞中DNA的含量高于RNA，一般會對從血液中分離出來的RNA使用DNase進行處理。
在開始制備RNA-Seq文庫之前，是否需要進行任何RNA 預處理在很大程度上取決于實驗設計、所選文庫預處理和樣本類型。在從血液中分離出的RNA樣本中，有兩個重要的"雜質"占據(jù)了很大的測序空間，它們是珠蛋白mRNA和核糖體RNA（rRNA）。
紅細胞中的珠蛋白mRNA量可占樣本中所有mRNA的 30-80%，而rRNA 則占總RNA的80-90 %。在mRNA-Seq實驗中，經(jīng)過poly(A)選擇后，這些轉錄本會消耗很大比例的測序讀數(shù)。此外，它們還影響了對血液轉錄譜的分析。
另外，如下圖所示，在沒有珠蛋白耗竭的情況下，基因檢測率會降低。從血液中分離的RNA樣本中去除rRNA及珠蛋白mRNA，可釋放出更多寶貴的測序空間，并將測序讀數(shù)集中到最重要的部分。
全血是一種珍貴、易得的樣本類型，也是制備血液RNA-Seq的樣本。不同的實驗設計和RNA-Seq類型，從全血中獲取高質量RNA-Seq數(shù)據(jù)的步驟會有所不同。無論選擇哪種方法，最佳實踐建議都是在采樣后立即滅活RNase以防止RNA降解；用DNase處理RNA樣品以去除gDNA，去除球蛋白mRNA以提高基因檢測率，如果是mRNA-Seq或總RNA-Seq，則同時去除rRNA，以釋放額外的測序空間。
實驗小貼士：少走彎路更高效
嚴格操作規(guī)范：RNA-seq實驗中稍有不慎便會影響結果，請確保每一步均符合標準操作規(guī)程。
批量處理樣本：為減少批次間誤差，建議一次性處理多個樣本，統(tǒng)一條件操作。
數(shù)據(jù)備份：測序數(shù)據(jù)是寶貴資產(chǎn)，請及時備份以防丟失。
為了幫助您輕松應對血液RNA-seq實驗中的各類挑戰(zhàn)，以下是值得推薦的產(chǎn)品清單：
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