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如何做好RNA提取
閱讀：2137發(fā)布時(shí)間：2022-1-25
如何做好RNA提取
RNA定義：
RNA作為重要的生物大分子，是生命現(xiàn)象的分子基礎(chǔ)之一。mRNA在信息傳遞中起很重要的作用ea6d18。其它兩大類RNA，rRNA和tRNA，同樣在蛋白質(zhì)的生物合成中發(fā)揮不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遺傳信息由DNA傳遞到表現(xiàn)生命性狀的蛋白質(zhì)的過程中舉足輕重。很多實(shí)驗(yàn)中也需要提取相應(yīng)樣本的RNA作為實(shí)驗(yàn)原料。
提取方法：
1.Trizol法異硫氰酸胍/苯酚法
TRIzol試劑有多組分分離作用，最大特點(diǎn)就是可同時(shí)分離一個(gè)樣品RNA/DNA/蛋白質(zhì)。TRIzol使樣品勻漿化，細(xì)胞裂解，溶解細(xì)胞內(nèi)含物，同時(shí)因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機(jī)相，RNA在水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA，用乙醇沉淀中間層可回收DNA，用異丙醇沉淀有機(jī)相可回收蛋白質(zhì)。
2.CTAB法
影響因素：
1.樣本材料：
●建議使用新鮮材料。切記使用反復(fù)凍融的材料。
●材料長期保存建議液氮，—80℃短期保存
2.樣本處理：
根據(jù)不同材料選擇不同的樣本處理
●培養(yǎng)細(xì)胞:通?？芍苯蛹恿呀庖毫呀?/span>
●酵母和細(xì)菌:直接液氮研磨，之后用Trizol裂解
●動植物組織:先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。
純化方案：
●經(jīng)典的沉淀方法，雖然經(jīng)濟(jì)，但操作時(shí)間長，易造成 RNA 降解;
●離心柱式純化方法:抽提速度快，能有效去除影響后續(xù)RNA酶反應(yīng)的雜質(zhì)。
●磁珠法：同時(shí)兼具了樣本需求低、操作方便、適配全自動化等優(yōu)點(diǎn)，目前是尤為常用的核酸純化方法。
常見問題：
1.RNA降解
●樣品取樣以及保存是否得當(dāng)
●裂解液的質(zhì)量
●外源RNase的污染
●裂解液的用量不足
●組織裂解不充分
●另外某些富含內(nèi)源酶的樣品(如脾臟，胸腺等)，很難避免RNA 的降解。
2.OD260/OD280<1.65
●檢測吸光度時(shí)，RNA樣品沒有溶于水，而溶于了TE中。低離子濃度和低PH值條件下OD280值偏高；
●樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少或樣本量過多；
●吸取水相時(shí)混入了有機(jī)相；
●RNA沉淀未*溶解。
3.RNA總量低
●樣本選擇問題：樣本自身豐度不足
●樣品裂解或勻漿處理不*；
●RNA沉淀未*溶解。
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