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使用DNA Extractor® Kit檢測殘留DNA
閱讀：670 發(fā)布時間：2020-7-6
富士膠片和光純藥株式會社 生命科學(xué)研究所 福地大樹
◆前言
包含疫苗在內(nèi)的大部分生物藥都是使用培養(yǎng)細胞或大腸桿菌生產(chǎn)的，有研究者指出，通過這種方式生產(chǎn)的原料藥、制劑可能會殘留著宿主細胞來源的DNA。不可否認，宿主細胞或病毒來源的致癌基因很可能會通過這些殘留DNA轉(zhuǎn)運過來，或引起病毒DNA感染事件。因此，殘留DNA的定量檢測是生物制藥和其工藝驗證中*的一部分。
有報告建議生物藥中每劑量殘留DNA的含量不超過100 pg[1] ，不僅是歐美地區(qū)，其他國家也愈發(fā)認為必須將定量檢測宿主細胞來源的殘留DNA作為質(zhì)量檢測項目之一。而檢測這種痕量殘留DNA，則需要從樣品中以高回收率提取痕量殘留DNA。
本文將介紹本公司銷售的DNA Extractor® Kit —— 一款可用于此類痕量殘留DNA檢測的DNA提取試劑盒。
◆關(guān)于DNA Extractor® Kit
若要檢測、定量生物藥中所含的DNA總量，必須先將其所含的DNA從蛋白質(zhì)等其他活性成分中分離、純化出來。傳統(tǒng)上分離DNA時通常會采用蛋白酶消化樣品，然后利用苯酚、三氯甲烷將DNA提取出來的方法。然而，這種方法卻有著這些缺點：在獲得相對高純度的DNA的同時，需要使用苯酚、三氯甲烷等有害物質(zhì)；并且需要花費工夫和時間進行提取操作。而使用二氧化硅等物質(zhì)作為載體的固相提取方法會因為DNA被吸附到載體上而導(dǎo)致其損耗，因此并不適合用于回收痕量DNA。同樣的，使用有機溶劑的方法的痕量DNA回收率也很低，這也是DNA提取試劑的問題之一。
本公司1992年起推出的DNA Extractor® Kit（中國藥典版本產(chǎn)品編號：292-81101），通過使用NaI法解決了以上問題，只需簡易的操作，便可以高回收率提取高純度的DNA。
◆DNA Extractor® Kit的原理
本試劑盒 中包含NaI和表面活性劑，NaI作為蛋白質(zhì)增溶劑（離液離子），與表面活性劑一同將樣品中以蛋白質(zhì)為主的成分轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇軤顟B(tài)，然后通過加入異丙醇，能夠選擇性地令核酸（主要是DNA）和糖原產(chǎn)生沉淀（即共沉淀）[2]。如上所述，該試劑盒實現(xiàn)了在不使用固相載體或有機溶劑的情況下，通過簡化的提純步驟獲得了沉淀物，以高回收率提取痕量DNA。
※ 本試劑盒組分：NaI溶液、N-月桂酰肌氨酸鈉溶液、洗凈液（A）、洗凈液（B）、糖原溶液
◆使用DNA Extractor® Kit提取DNA與定量DNA總量案例
筆者將在下文中重新介紹一次曾刊載于本公司和光純藥時報Vol.60 No,3 p.28（1992）中的案例，該案例報道了關(guān)于本試劑盒在存在賦形劑以及添加劑的情況下的DNA加標(biāo)回收率。在該實驗中，分別將通常用作賦形劑或添加劑的物質(zhì)（精氨酸、尿素等）和蛋白質(zhì)（BSA（牛血清白蛋白）和人γ球蛋白）以常量或過量溶解于磷酸鹽緩沖液中，然后添加pg級的小牛胸腺DNA從而得到模型溶液。
接下來，按照DNA Extractor® Kit的實驗步驟，對400 µL的每種模型溶液進行DNA提取處理。將所得沉淀物溶解于500 μL的磷酸鹽緩沖液中進行閾值法總DNA定量※[3][4]，測定其DNA的加標(biāo)回收率。測定結(jié)果如表1所示。
賦形劑及其含量 | DNA添加量（pg） | DNA回收率（%） | |
山梨糖醇 | 200 mg/mL | 50 | 95 |
50 mg/mL | 50 | 94 | |
麥芽糖 | 400 mg/mL | 50 | 89 |
200 mg/mL | 50 | 102 | |
50 mg/mL | 50 | 98 | |
甘露醇 | 200 mg/mL | 50 | 84 |
葡萄糖 | 200 mg/mL | 50 | 81 |
蔗糖 | 200 mg/mL | 50 | 92 |
尿素 | 1 mol/L | 50 | 106 |
精氨酸 | 200 mg/mL | 50 | 110 |
γ球蛋白 | 60 mg/mL | 10 | 102 |
60 mg/mL | 5 | 84 | |
60 mg/mL | 2.5 | 88 | |
BSA | 200 mg/mL | 10 | 95 |
表1. 在存在賦形劑以及添加劑的情況下的DNA加標(biāo)回收率
我們對5種糖類的不同濃度下的DNA回收率進行了測定，所有DNA加標(biāo)回收率都在80%~110%范圍內(nèi)。另外，在精氨酸和尿素中也能夠以高回收率提取DNA。在蛋白質(zhì)方面，我們測定了BSA（牛血清白蛋白）和人γ球蛋白，發(fā)現(xiàn)兩者的DNA回收率都很高。根據(jù)樣品不同（如蛋白質(zhì)種類），可能會發(fā)生蛋白質(zhì)沉淀的情況，這種情況下只需稀釋或使用蛋白酶處理即可[5]。從以上結(jié)果來看，本試劑盒可對廣泛樣品以高重復(fù)性和高回收率提取殘留DNA。
※“閾值法總DNA定量”是指利用Molecular Devices公司的“Threshold® Total DNA assay system”進行的DNA總量定量的測定方法，是一種不依賴于序列的DNA定量測定方法。
該方法的總DNA檢測靈敏度為2 pg/assay。
◆使用DNA Extractor® Kit提取痕量殘留DNA與通過qPCR法進行定量的案例
如上所述，“Threshold® Total DNA assay system”是一種總DNA定量法，并不針對特定序列進行檢測。如果希望檢測出宿主細胞來源的殘留DNA，可以利用qPCR法將特定序列作為檢測對象。相對于閾值法的DNA定量，qPCR法有著能更高靈敏度檢測殘留DNA的這一優(yōu)點，接下來我們將圍繞其能否提取假定宿主細胞來源的痕量DNA進行探討。
在本實驗案例中，我們將常用于蛋白和抗體生產(chǎn)的CHO細胞（中國倉鼠卵巢細胞系細胞）以及大腸桿菌的基因組DNA作為殘留DNA模型，通過提取痕量殘留DNA以及以qPCR對其進行定量。實驗步驟如圖1所示。
圖1. 實驗步驟
首先，在100 μL的水（注射用蒸餾水）中添加了0.1 pg～100 pg各基因組DNA的樣品，使用本公司的DNA提取試劑盒對上述樣品提取DNA，然后將提取的DNA溶解于100 μL的水中。之后采用qPCR，并根據(jù)同時值得的校準(zhǔn)曲線計算出添加DNA的回收量。結(jié)果，大腸桿菌基因組和CHO細胞基因組在0.1 pg～100 pg之間的加標(biāo)回收率為85～120%（雖未在文中展示數(shù)據(jù)，但兩種基因組在1000 pg以內(nèi)回收率幾乎為100%）。
接下來，進行模擬細胞培養(yǎng)上清液中含有殘留DNA的實驗。細胞培養(yǎng)上清液樣品通過將0.1 pg CHO細胞基因組DNA添加到500 μL在10％FBS DMEM中培養(yǎng)3天的人胰腺癌細胞系Panc-1的培養(yǎng)上清液中配制而成。結(jié)果，根據(jù)生成的校準(zhǔn)曲線所得的回收量為0.093 pg。通過上述實驗證明，使用本試劑盒，即使是500 μL中所含殘留DNA僅為0.1 pg（100 fg）的fg級別的痕量DNA也以高回收率進行提取。另外，由于DNA Extractor® Kit可以以90%以上的高回收率回收存在于水、磷酸鹽緩沖液或是細胞培養(yǎng)上清液等樣品中的痕量殘留DNA（表1表2），因此可以證明本試劑盒的高回收率在不同樣品中具有廣泛性。
樣品 | DNA量 | 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得回收DNA量（pg） | 加標(biāo)回收率（%） |
注射用蒸餾水 | 0.1 pg | ND（低于檢測下限） | － |
1 pg | 1.031 | 103 | |
10 pg | 11.09 | 111 | |
100 pg | 85.1 | 85 | |
注射用蒸餾水 | 0.1 pg | 0.933 | 93 |
0.1 pg | 1.187 | 119 | |
10 pg | 11.57 | 116 | |
100 pg | 87.1 | 87 | |
人類細胞培養(yǎng)上清液 | 0.1 pg | 0.0928 | 93 |
表2. 基因組DNA加標(biāo)回收率
◆結(jié)語
使用DNA Extractor® Kit，能夠以高回收率回收樣品中所含殘留DNA。在定量殘留DNA時，從樣品中提取DNA是十分重要的一個步驟，即便是痕量殘留DNA也可以通過本試劑盒進行高回收率提取。另外，由于本試劑盒能夠用于廣泛的樣品，因此我們認為它不僅能用于CHO細胞，還能用于大腸桿菌和酵母等其他宿主細胞來源的殘留DNA，有望在生物制藥的質(zhì)控中發(fā)揮作用。
◆參考文獻
1. Knezevic et al. : Biologicals, 36:203-211(2008).
2. Ishizawa, M et al. : Nucleic Acids Res., 19, 5792(1991).
3. Kung. V. T et al. : Anal. Biochem., 187, 220-227(1990).
4. 水沢左衛(wèi)子, 本間玲子. : Pharm Tech. Japan, 7, 309-314, 426-431(1991).
5. 和光純薬時報 Vol.61 p.27(1993)
◆產(chǎn)品列表
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
292-81101 | DNA Extractor™ Kit for Residual DNA, CP Method | 50 tests |