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優(yōu)化原位雜交（ISH）的10個小技巧
閱讀：1415 發(fā)布時間：2018-12-2710 Tips for Optimizing In Situ Hybridization (ISH)
Enzo Life Sciences在研究試劑盒，生物化學品和生物制品的制造和供應方面擁有40多年的經驗。 作為為科學家提供支援的科學家，我們很樂意提供簡單但有用的技巧，以改善您日常任務以及研究的整體質量。 從這一點出發(fā)，以下我們?yōu)槟峁┝嗽谠浑s交中獲得高質量數(shù)據的綜合技巧。 原位雜交是一種廣泛使用的生物技術，它能為準確定位分裂中期滴片、細胞和組織中內源性的、細菌或病毒的核酸（如DNA，mRNA和microRNA）。 |
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1．合適的探針
由于雜交可以發(fā)生在互補的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之間，故DNA或RNA探針（又稱為核糖探針）都可以用于定位給定樣品中的DNA或RNA。然而，RNA-RNA雜交體比RNA-DNA雜交體更穩(wěn)定，而RNA-DNA雜和體又比DNA-DNA雜合體更穩(wěn)定。雙鏈DNA探針易于在實驗室中進行制備、標記和使用；而單鏈RNA探針的大小均一，可實現(xiàn)標記的高度插入，并形成高度穩(wěn)定的RNA-RNA雜交體。而且，單鏈寡核苷酸探針（Oligonucleotides）如今可以通過化學方法簡單地合成并且加上高比放射性。目前，也可以使用肽骨架或鎖核酸（LNA）作為替代品，以提高雜交效率和穩(wěn)定性。
2．合適的標簽
用于組織微陣列的放射性標記探針應使用35S-NTP，以避免信號溢出。如果實驗目的是使與周圍細胞或組織結合的探針可視化（·常見的情況），那么您可以選擇能夠使探針能被直接檢測的一系列熒光染料。又或者，您可以使用如生物素、地·高辛或者色原體等間接標記，這類標記不易隨著時間變化而發(fā)生信號猝滅，與免疫組織化學（IHC）類似。
3．正確的標記技術
缺口平移法或隨機引物標記法是產生長的雙鏈DNA探針的方法（推薦使用ENZ-GEN111-0050），而使用含RNA聚合酶啟動子的載體則可用于體外轉錄以制備RNA探針。寡核苷酸可以在其合成期間直接標記，或者可以使用末端脫氧核苷酸轉移酶或T4多聚核苷酸激酶將標記的核苷酸添加至其末端。
4．合適的檢測方法
由于熒光標記可以在FISH探針合成期間引入并通過熒光顯微鏡檢測，因此可以進行直接檢測。這樣，可以容易地進行多重檢測，因為可以在任何時間觀察兩種或更多種不同熒光團標記的不同探針（推薦ENZO SEEBRIGHTTM系列）。生物素標記可以用來自蛋清的親和素或來自細菌S. avidinii的鏈霉親和素檢測，而地·高辛可以與地·高辛抗體配對。兩種間接標記方法終可以用堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化物酶（HRP）來處理，與特定底物反應產生CISH的顯色沉淀，從而達到可視化的目的。
5．優(yōu)化蛋白酶K的消化
蛋白酶K的消化是ISH成功的關鍵步驟，因為消化不足將導致雜交信號減弱。另一方面，如果樣品過度消化，組織的形態(tài)將會很差或*被破壞，導致無法定位雜交信號。因此，蛋白酶K的·佳濃度會根據組織類型、固定長度和組織大小而變化。 通常，在室溫下使用1-5 μg/ mL蛋白酶K處理 10min是開展ISH的一個不錯的起始點。蛋白酶K消化·佳條件的確定應以系列不同濃度的蛋白酶K進行滴定，然后再與所選擇的探針雜交。產生·高雜交信號且蛋白質組織或細胞形態(tài)被破壞少時的蛋白酶K濃度即為您應該選擇的濃度。
6．強化雜交條件
強化雜交條件的目的是僅在探針和其靶標之間獲得雜交，從而實現(xiàn)可能的·高特異性。雜交特異性（嚴格度）主要由探針和靶核酸序列之間的同源性程度、探針濃度、溫度和雜交時間，以及雜交溶液中存在的單價陽離子的濃度所決定。尤其應該仔細地優(yōu)化雜交溫度，通常在55和62°C之間，以獲得高度特異性的結果。甲酰胺允許雜交在顯著低于探針-靶-雜交體的實際解鏈溫度的溫度下進行，從而有助于保護樣品的形態(tài)。為了更好地標記目的基因，通常會引入COT序列（ENZ-GEN116-0500）以減少與重復DNA序列的非特異性雜交。
7．優(yōu)化雜交后處理條件
反應之后，接下來進行的是增加嚴格度的雜交后洗滌，以出去不*的配對，使靶序列上僅留下特異性結合的探針。如果您在ISH分析中遇到高背景，您可以用核酸酶消化非特異性結合的探針來進一步降低背景。例如，在進行檢測步驟之前，使用S1核酸酶處理DNA探針，使用RNase來處理RNA探針。
8．如果使用DNA探針，修改洗滌步驟
DNA探針有著與RNA探針相同的靈敏度，但DNA探針不能像RNA探針那樣與樣品中的靶分子結合得那么牢固。 因此，當使用DNA探針時，不應在雜交后使用甲醛洗滌。
9．優(yōu)化檢測
使用生物素標記的探針時，請注意生物素也是在細胞和組織中產生的內源性物質。因此，內源性的生物素可能導致非特異性染色，因為基于（鏈霉）親和素的檢測系統(tǒng)將與樣品中所有可接觸的生物素分子結合。在這些情況下，您需要通過在探針雜交之前向樣品中添加過量（鏈霉）親和素來阻斷內源性生物素，或者您應該使用地·高辛代替生物素來作為探針標記。地·高辛是從洋地黃植物中分離的非放射性免疫標簽，因此不太可能被除抗地·高辛抗體之外的生物材料檢測到。因此，地·高辛標記的使探針檢測有著高親和力、高靈敏度以及重要的特異性。
10．經常更換試劑
為了獲得具可重復性和有效的數(shù)據，應每2-3周補充一次三乙醇胺和乙酸酐，每3-4天更換10％中性甲醛溶液（NBF）。
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