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◆免疫分析樣品的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)——什么是基質(zhì)干擾？

 

      酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）是一種基于微孔板的技術(shù)，常用于檢測(cè)和定量各種生物樣品中人們所感興趣的低豐度待測(cè)分析物。該技術(shù)取決于兩個(gè)要素：（1）通過由酶和標(biāo)記二抗結(jié)合所產(chǎn)生的比色產(chǎn)物的顯影來高度準(zhǔn)確地測(cè)定抗體-抗原間的相互作用；（2）基于上述相同的相互作用，以標(biāo)準(zhǔn)參考重組蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線， 然后再與之前的結(jié)果準(zhǔn)確比對(duì)，從而得出生物樣品中待測(cè)物的濃度。

 

      在市售的ELISA試劑盒中，準(zhǔn)確測(cè)量分析物的關(guān)鍵，是對(duì)您的*樣品和（或）未經(jīng)試劑盒制造商驗(yàn)證的樣品進(jìn)行測(cè)試。由于不同的抗體-分析物有不同的結(jié)合特征，且目標(biāo)分析物中樣品基質(zhì)的背景中存在固有內(nèi)源物質(zhì)的差異，可能會(huì)使得這些樣品難以用試劑盒中的抗體獲得穩(wěn)健的檢測(cè)和定量效果。這稱為樣品的基質(zhì)干擾。這些干擾物質(zhì)是結(jié)構(gòu)相似但化學(xué)性質(zhì)有差異的化合物，它會(huì)與靶向目標(biāo)分析物發(fā)生抗體交叉反應(yīng)。

      受到這種干擾時(shí)，樣品基質(zhì)中內(nèi)源性干擾物質(zhì)或外源性污染物會(huì)導(dǎo)致光學(xué)密度（OD值）錯(cuò)誤地增加或減少，不能反映分析物濃度真實(shí)水平。會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)干擾的樣品包括一些富含蛋白質(zhì)的樣品，或一些具有潛在基質(zhì)干擾的樣品， 如尿液、細(xì)胞裂解液和血液成分（血清和血漿）。

 

      除了樣品固有的內(nèi)源性物質(zhì)和由于人為錯(cuò)誤產(chǎn)生的外源性污染物之外，使用者可能還需要評(píng)估測(cè)定用的稀釋緩沖液與潛在的干擾組分之間的相容性。干擾組分可以是pH依賴性的、去垢型的或有機(jī)溶劑型的，緩沖溶液鹽的組成和濃度會(huì)決定緩沖液的相容性。有時(shí)候可能需要更換緩沖液來排除干擾，以便能檢測(cè)樣品中分析物的真實(shí)濃度。另一方面，當(dāng)分析物的水平顯著升高到超過測(cè)定的定量限（LOQ）時(shí)，優(yōu)化樣品的稀釋度成為克服這種干擾的一種策略。為了確保樣品能準(zhǔn)確地檢測(cè)和定量，并減輕樣品基質(zhì)效應(yīng)，終端用戶可能需要考慮通過加標(biāo)-回收以及稀釋線性實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行樣品檢驗(yàn)。

 

◆加標(biāo)-回收實(shí)驗(yàn)

 

      加標(biāo)和回收實(shí)驗(yàn)的主要目標(biāo)，是確定分析物的檢測(cè)是否受到使用者制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)所用的測(cè)定稀釋劑/緩沖液與樣品基質(zhì)之間的差異的影響。樣品基質(zhì)可以是純的（未稀釋的）生物樣品或以測(cè)定稀釋劑稀釋的生物樣品。這是通過將已知量的重組蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品加入天然測(cè)試樣品基質(zhì)中（加標(biāo)），并觀察其相對(duì)于向測(cè)定稀釋劑中加入相同已知量的重組蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)（回收）來實(shí)現(xiàn)的。

      響應(yīng)（終濃度）可以根據(jù)添加的重組蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物的量從標(biāo)準(zhǔn)曲線和OD值來計(jì)算得出。在運(yùn)行兩組響應(yīng)并從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出濃度后，終端用戶可以計(jì)算出回收百分比，以確定觀察到的加標(biāo)樣品值與觀察到的未加標(biāo)樣品值相對(duì)于實(shí)際已知量的百分比偏差，從而確定稀釋劑和樣品基質(zhì)的兼容性。

      作為使用者，他們希望在樣品基質(zhì)和測(cè)定稀釋劑/緩沖液中對(duì)給定的目標(biāo)分析物實(shí)現(xiàn)相同的響應(yīng)。換句話說，*相容的樣品基質(zhì)應(yīng)該獲得100％的回收率，因?yàn)榧訕?biāo)后所觀察到的回收率在稀釋劑測(cè)定時(shí)和樣品基質(zhì)測(cè)定時(shí)所獲得的回收率是應(yīng)該相同的。

      回收率大可能會(huì)偏離20％。如果回收的值與預(yù)期的量有顯著出入（根據(jù)加入已知的量來計(jì)算得出），那么與100％回收率對(duì)比所發(fā)生的偏差可能能夠表明稀釋劑與樣品基質(zhì)的不相容性/差異程度，在這種情況下必須進(jìn)行調(diào)整來盡量減少偏差。在樣品回收率非常差的情況下， 建議使用其他不同的、其組成與樣品基質(zhì)更加接近的分析稀釋劑。

 

◆稀釋線性實(shí)驗(yàn)

 

      如樣品在系列稀釋下未呈現(xiàn)出線性，則表明在給定稀釋度下，基質(zhì)組分干擾了對(duì)目標(biāo)分析物的準(zhǔn)確檢測(cè)。因此，使用者將樣品稀釋至觀察不到干擾時(shí)，有必要校正稀釋因子。進(jìn)行稀釋線性實(shí)驗(yàn)是為了證明，加標(biāo)濃度高于定量上限的樣品可稀釋至工作標(biāo)曲范圍內(nèi)的濃度，并仍可以產(chǎn)生準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。

      鉤狀效應(yīng)所帶來的不良線性，也可通過實(shí)現(xiàn)稀釋線性來減輕。當(dāng)分析物的濃度開始超過抗體的量時(shí)，會(huì)產(chǎn)生鉤狀效應(yīng)。這時(shí)候，隨著分析物濃度開始遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出可用的抗體的量時(shí)，劑量反應(yīng)曲線的平臺(tái)在進(jìn)一步增長(zhǎng)時(shí)的斜率會(huì)開始變負(fù)，說明出現(xiàn)了潛在的基質(zhì)干擾且的分析物濃度定量的準(zhǔn)確性開始降低。

      使用合適的、精選的稀釋劑在分析范圍內(nèi)來對(duì)樣品進(jìn)行系列梯度稀釋。當(dāng)稀釋線性出現(xiàn)時(shí)，連續(xù)的稀釋點(diǎn)OD值會(huì)出現(xiàn)線性變化，或者每個(gè)稀釋點(diǎn)乘以稀釋倍數(shù)后，將計(jì)算得到大致相同的樣品濃度。例如，如果使用者進(jìn)行兩倍連續(xù)稀釋，則每個(gè)點(diǎn)之間的OD值大致應(yīng)該有兩倍的差異。對(duì)于已知小所需稀釋度（MRD）的已測(cè)樣品，在理論上該值可作為起始點(diǎn)，然后通過一系列的稀釋來確定該起始點(diǎn)是否合適。如果樣品尚未經(jīng)過檢測(cè)，則可能需要通過以一個(gè)更大范圍的稀釋度的滴定來確定MRD， 從而實(shí)現(xiàn)線性。稀釋線性能保證測(cè)試的高度準(zhǔn)確性并且表明該測(cè)試在不同稀釋度下具有靈活性。

      進(jìn)行稀釋線性實(shí)驗(yàn)也可以通過制備幾種具有低濃度分析物的樣品的稀釋液，將已知量的相同分析物摻入每一個(gè)稀釋液中，然后通過比較未加標(biāo)和（或）未稀釋樣品的所觀察到的值和預(yù)期的值，從而來測(cè)試和評(píng)估測(cè)定回收率。在稀釋后，擁有理想線性的樣品，所被觀察到的樣品濃度相對(duì)于其終濃度來說不應(yīng)該出現(xiàn)變化。當(dāng)樣品回收率可在預(yù)期值的80％至120％范圍之內(nèi)，即可實(shí)現(xiàn)線性?？紤]到稀釋數(shù)據(jù)在測(cè)定范圍內(nèi)的低端會(huì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的限制，因此應(yīng)該避免有低于測(cè)定中定量限兩倍的值。

 

 

◆總結(jié)

 

      Enzo Life Sciences有著各式各樣的ELISA試劑盒，旨在檢測(cè)各種生物標(biāo)志物，有著多種樣品基質(zhì)可供測(cè)試。我們的試劑盒廣受歡迎，而Enzo Life Sciences在開發(fā)和優(yōu)化商業(yè)免疫檢測(cè)方面有著數(shù)十年的經(jīng)驗(yàn)，可以滿足科學(xué)界不斷變化的需求。

      我們提供廣泛的免疫測(cè)定試劑盒，用于監(jiān)測(cè)野生動(dòng)物的壓力，生殖，健康，福利和生存。我們較受歡迎的用于量化17β-雌二醇，黃·體酮，睪酮，皮質(zhì)醇和皮質(zhì)酮的ELISA用于許多出版物和協(xié)議，已被*的動(dòng)物園，水族館和保護(hù)科學(xué)家所使用。我們很樂意為您的研究需求提供簡(jiǎn)單而實(shí)用的技巧和指導(dǎo)。如需訂購(gòu)請(qǐng)聯(lián)系客服。