Chromatin Immunoprecipitation(ChIP)實(shí)驗(yàn)技術(shù)總結(jié)

ChIP是一項(xiàng)比較流行的研究轉(zhuǎn)錄因子（transcriptionfactor,TF）與啟動(dòng)子（promoter）相互結(jié)合的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。由于ChIP采用甲醛固定活細(xì)胞或者組織的方法，所以能比較真實(shí)的反映細(xì)胞內(nèi)TF與Promoter的結(jié)合情況。當(dāng)用甲醛處理時(shí)，相互靠近的蛋白與蛋白，蛋白與核酸（DNA或RNA）之間會(huì)產(chǎn)生共價(jià)鍵。細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)TF與Promoter相互結(jié)合（生物意義上的結(jié)合）時(shí)，它們必然靠的比較近，或者契合在一起，這個(gè)時(shí)候用甲醛處理，能使它們之間產(chǎn)生共價(jià)鍵。

原理：活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)/DNA復(fù)合物—超聲或酶處理將其隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段—抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)沉淀此復(fù)合體—特異性富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段—對(duì)目的片斷進(jìn)行純化與檢測(cè)—獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。

對(duì)于剛接觸ChIP實(shí)驗(yàn)的同學(xué)，丁香園lorry_zgf師兄的實(shí)力技術(shù)總結(jié)肯定會(huì)讓您豁然開朗！

一：細(xì)胞篇

細(xì)胞的生長狀態(tài)要好。因?yàn)榧?xì)胞的生長狀態(tài)直接影響細(xì)胞內(nèi)部的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也很有可能影響你所研究的TF與其靶Promoter的結(jié)合。一般細(xì)胞長到75％-80％比較好。

二：抗體篇

抗體是實(shí)驗(yàn)成敗的致命因素之一！必須是IP級(jí)別的抗體。單抗與多抗的選擇也需要仔細(xì)考慮。兩種抗體各有利弊。單抗特異性強(qiáng)，背景低。但是單抗有一個(gè)致命的弱點(diǎn)，就是識(shí)別位點(diǎn)單一，而在ChIP甲醛交聯(lián)的過程中，很有可能該位點(diǎn)被其它蛋白或核酸結(jié)合而被封閉，導(dǎo)致單抗不能識(shí)別靶蛋白。多抗雖然沒有這個(gè)問題，但是多抗特異性較差，背景可能會(huì)偏高。一般而言，如果沒有十足把握（單抗的識(shí)別位點(diǎn)遠(yuǎn)離靶蛋白與核酸結(jié)合的區(qū)域），選擇多抗比較穩(wěn)妥一些。

三：交聯(lián)與超聲破碎篇

交聯(lián)的程度會(huì)影響到超聲破碎的效果，交聯(lián)的程度越高，超聲破碎就越不易把基因組打碎成小片段。
交聯(lián)不充分，只有一部分靶蛋白與其Promoter相結(jié)合，富集得到的Promoter的量不高，實(shí)驗(yàn)假陰性。交聯(lián)過充分，基因組上結(jié)合了太多的蛋白，對(duì)超聲破碎造成障礙。另外也會(huì)增加背景。一般來講，按照我的經(jīng)驗(yàn)，交聯(lián)條件取決于細(xì)胞類型。不同的細(xì)胞系，交聯(lián)的條件也不一樣。例如：NIH-3T3的交聯(lián)條件是室溫（25攝氏度）下15min，1％的甲醛濃度，而別的細(xì)胞系則可能*不一樣。而超聲破碎的條件，機(jī)器不一樣，條件也不一樣。當(dāng)然如果你有bioruptor這樣的神器，那么超聲破碎對(duì)你而言就是小菜一碟了。一般，理想的超聲破碎得到的片段大小是200bp-1000bp。但是200bp-2000bp的范圍也是可以接受的。

四：操作篇

盡可能的保持低溫（4度）。沉淀的時(shí)候可以先在4度放置一會(huì)，等它自然沉降一些，再超低轉(zhuǎn)速（500rpm等）離心使其*沉降。說明書上說ChIP實(shí)驗(yàn)的過程中有幾個(gè)可以停頓的地方，能夠連續(xù)做完，直到PCR結(jié)果出來為止。盡量避免實(shí)驗(yàn)中不可預(yù)知的影響因素。

五：解交聯(lián)篇

說明書上說4小時(shí)已經(jīng)足夠，但建議解交聯(lián)過夜。因?yàn)樵谀菢拥沫h(huán)境里，DNA不會(huì)降解，過夜解交聯(lián)更充分些。只是不要忘記在EP管口封上封口膜。

六：DNA片段的回收篇

樣品中SDS樣品較高，普通的PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，很有可能會(huì)在zui終的樣品中混入SDS，影響PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。小Tip：過柱前，在樣品中加入一定量的異丙醇，能有效的消除SDS沉淀。