一、細胞凋亡的形態(tài)學檢測

根據凋亡細胞固有的形態(tài)特征，人們已經設計了許多不同的細胞凋亡形態(tài)學檢測方法。

1 光學顯微鏡和倒置顯微鏡

2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

3 透射電子顯微鏡觀察

二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。將Annexin-V進行熒光素（FITC、PE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。

注意事項

1、整個操作動作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞。

2、 操作時注意避光，反應完畢后盡快在一小時內檢測。

Abbkine的Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒含有Abbkine專有的AbFluor™染料標記的Annexin V，可通過流式細胞儀或熒光顯微鏡對凋亡細胞進行鑒定和定量。同時使用AbFluorTM染料和碘化丙啶（PI）對細胞進行染色可以區(qū)分完整細胞，早期凋亡和晚期凋亡或壞死細胞。

三、線粒體膜勢能的檢測

線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位的下降，被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應過程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細胞核凋亡特征（染色質濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細胞凋亡不可逆轉。

線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可結合到線粒體基質，其熒光的增強或減弱說明線粒體內膜電負性的增高或降低。

注意事項

1、始終保持平衡染液中pH值的一致性，因為pH值的變化將影響膜電位。

2、與染料達到平衡的細胞懸液中如果含有蛋白，他們將與部分染料結合，降低染料的濃度，引起假去極化。

四、DNA片斷化檢測

細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質發(fā)生濃縮, 染色質DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50~300kbp長的DNA大片段, 或180~200bp整數倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細胞經處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）使DNA標記，然后進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成。

1.大分子染色體DNA片段的測定

2.DNA Ladder 測定

3.凋亡細胞DNA含量的流式細胞計分析

五、TUNEL法

細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學與形態(tài)學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態(tài)測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。

六、Caspase-3活性的檢測

Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。

七、凋亡相關蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析

TFAR19（PDCD5）是由本研究室在國際上首先報導的一個擁有自己知識產權的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進細胞凋亡的增強劑。利用熒光素（FITC）標記的TFAR19單克隆抗體為探針，對細胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達水平及定位研究發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19表達水平增高并出現(xiàn)快速核轉位現(xiàn)象，伴隨著細胞核形態(tài)學的變化，持續(xù)較長時間，在凋亡小體中仍然可見。同時我們發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉位是細胞凋亡更早期發(fā)生的事件之一。進一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉位具有普遍意義，不同細胞凋亡早期均出現(xiàn)TFAR19高表達和核轉位。這為研究細胞凋亡早期所發(fā)生的事件，提供了一種新的技術和指標。