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            丙酮酸（PA）測(cè)定試劑盒 微量法

測(cè)定意義：丙酮酸通過(guò)乙酰CoA連接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代謝，起著重要的樞紐作用。

測(cè)定原理：丙酮酸與2,4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，在堿性溶液中呈櫻紅色。

需要的儀器，耗材:可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水。 

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丙酮酸（pyruvic acid PA）含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100 管/96 樣 正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義： 丙酮酸通過(guò)乙酰 CoA 連接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代謝，起著重要的樞紐作用。 測(cè)定原理： 丙酮酸與 2,4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，在堿性溶液中呈顯色。 需自備的儀器和用品： 可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰、 蒸餾水。

試劑的組成和配制： 提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 2.5mL×1 瓶， 4℃保存；

試劑二：液體 12.5mL×1 瓶， 4℃保存。

丙酮酸提?。?/strong> 1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量 （104個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提 取液），超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次），靜置 30min， 8000g，25℃離心 10min，取上清待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿，靜置 30min，8000g，25℃離心 10min，取上清待測(cè)。

3、血清（漿）樣品：按照血清（漿）體積（mL）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建 議取 0.1mL 血清（漿）加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿，靜置 30min， 8000g，25℃離心 10min，取上清待測(cè)。

測(cè)定步驟： 1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng) 520nm，蒸餾水調(diào)零。 2、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 75μL 樣本和 25μL 試劑一，混勻，靜置 2min，加入 125μL 試劑二，混勻，于 520nm 波長(zhǎng)處測(cè)定管吸光值 A。

丙酮酸含量計(jì)算： a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 0.0466x + 0.0675； x 為丙酮酸鈉含量（µg/mL），y 為吸 光值。

2、按照血清（漿）體積計(jì)算 丙酮酸含量（μg/mL）= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷（V3×V1÷V2）=214.6×(A-0.0675)

3、按照蛋白濃度計(jì)算 丙酮酸含量（μg/mg prot）=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(V1×Cpr)=21.46×(A-0.0675) ÷Cpr

4、按照樣品質(zhì)量計(jì)算 丙酮酸含量（µg/g 鮮重）= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(W ×V1÷V2）=21.46×(A-0.0675) ÷W

5、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算 丙酮酸含量（μg/104 cell）＝[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷（500×V1÷V2）=0.043×(A-0.0675)

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.075mL；V2：加入提取液體積，1 mL；V3：加入血清（漿） 體積，0.1 mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)， 500 萬(wàn)。

b.用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 0.0233x + 0.0675； x 為丙酮酸鈉含量（µg/mL），y 為吸 光值。

2、按照血清（漿）體積計(jì)算 丙酮酸含量（μg/mL）= [(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷（V3×V1÷V2）=429.2×(A-0.0675)

3、按照蛋白濃度計(jì)算 丙酮酸含量（μg/mg prot）=[(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷(V1×Cpr)=42.92×(A-0.0675) ÷Cpr

4、按照樣品質(zhì)量計(jì)算 丙酮酸含量（µg/g 鮮重）= [(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷(W ×V1÷V2）=42.92×(A-0.0675) ÷W

5、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算 丙酮酸含量（μg/104 cell）＝[(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷（500×V1÷V2）=0.086×(A-0.0675) V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.075mL；V2：加入提取液體積，1 mL；V3：加入血清（漿） 體積，0.1 mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)， 500 萬(wàn)。 注意：低檢測(cè)限為 100μg/mL 或 100μg/g 鮮重或 1μg/mg prot