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更新時(shí)間:2025-02-27 21:00:08
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丙酮酸(PA)測(cè)定試劑盒 微量法
測(cè)定意義:丙酮酸通過(guò)乙酰CoA連接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代謝,起著重要的樞紐作用。
測(cè)定原理:丙酮酸與2,4-二硝基苯肼作用,生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙,在堿性溶液中呈櫻紅色。
需要的儀器,耗材:可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水。
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Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd
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丙酮酸(pyruvic acid PA)含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法 100 管/96 樣 正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義: 丙酮酸通過(guò)乙酰 CoA 連接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代謝,起著重要的樞紐作用。 測(cè)定原理: 丙酮酸與 2,4-二硝基苯肼作用,生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙,在堿性溶液中呈顯色。 需自備的儀器和用品: 可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰、 蒸餾水。
試劑的組成和配制: 提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存;
試劑一:液體 2.5mL×1 瓶, 4℃保存;
試劑二:液體 12.5mL×1 瓶, 4℃保存。
丙酮酸提?。?/strong> 1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量 (104個(gè)):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提 取液),超聲波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次),靜置 30min, 8000g,25℃離心 10min,取上清待測(cè)。
2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織, 加入 1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿,靜置 30min,8000g,25℃離心 10min,取上清待測(cè)。
3、血清(漿)樣品:按照血清(漿)體積(mL):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建 議取 0.1mL 血清(漿)加入 1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿,靜置 30min, 8000g,25℃離心 10min,取上清待測(cè)。
測(cè)定步驟: 1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng) 520nm,蒸餾水調(diào)零。 2、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 75μL 樣本和 25μL 試劑一,混勻,靜置 2min,加入 125μL 試劑二,混勻,于 520nm 波長(zhǎng)處測(cè)定管吸光值 A。
丙酮酸含量計(jì)算: a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 0.0466x + 0.0675; x 為丙酮酸鈉含量(µg/mL),y 為吸 光值。
2、按照血清(漿)體積計(jì)算 丙酮酸含量(μg/mL)= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(V3×V1÷V2)=214.6×(A-0.0675)
3、按照蛋白濃度計(jì)算 丙酮酸含量(μg/mg prot)=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(V1×Cpr)=21.46×(A-0.0675) ÷Cpr
4、按照樣品質(zhì)量計(jì)算 丙酮酸含量(µg/g 鮮重)= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(W ×V1÷V2)=21.46×(A-0.0675) ÷W
5、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算 丙酮酸含量(μg/104 cell)=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(500×V1÷V2)=0.043×(A-0.0675)
V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.075mL;V2:加入提取液體積,1 mL;V3:加入血清(漿) 體積,0.1 mL; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù), 500 萬(wàn)。
b.用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 0.0233x + 0.0675; x 為丙酮酸鈉含量(µg/mL),y 為吸 光值。
2、按照血清(漿)體積計(jì)算 丙酮酸含量(μg/mL)= [(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷(V3×V1÷V2)=429.2×(A-0.0675)
3、按照蛋白濃度計(jì)算 丙酮酸含量(μg/mg prot)=[(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷(V1×Cpr)=42.92×(A-0.0675) ÷Cpr
4、按照樣品質(zhì)量計(jì)算 丙酮酸含量(µg/g 鮮重)= [(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷(W ×V1÷V2)=42.92×(A-0.0675) ÷W
5、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算 丙酮酸含量(μg/104 cell)=[(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷(500×V1÷V2)=0.086×(A-0.0675) V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.075mL;V2:加入提取液體積,1 mL;V3:加入血清(漿) 體積,0.1 mL; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù), 500 萬(wàn)。 注意:低檢測(cè)限為 100μg/mL 或 100μg/g 鮮重或 1μg/mg prot
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)