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產(chǎn)品貨號(hào) ：CA1310
產(chǎn)品規(guī)格 ：100T
產(chǎn)品內(nèi)容 ：

保存條件 ：
    -20 ℃避光保存，盡量避免反復(fù)凍融，有效期一年。 超純水和 JC-10 染色緩沖液（5 ×）也可 4 ℃保存。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介 ：
    線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-10 ）是一種以 JC-10 為熒光探針，快速靈敏地檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，可以用于早期的細(xì)胞凋亡檢測(cè)。
    JC-10 是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位 Ψm  △ 的理想熒光探針。 可以檢測(cè)細(xì)胞、 組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-10 聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-10 不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí) JC-10 為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。這樣就可以非常方便地通過(guò)熒光顏色的轉(zhuǎn)變來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對(duì)比例來(lái)衡量線粒體去極化的比例。
    線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。通過(guò) JC-10 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測(cè)到細(xì)胞膜電位的下降，同時(shí)也可以用 JC-10 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)。
    JC-10 單體的大激發(fā)波長(zhǎng)為 515nm ，大發(fā)射波長(zhǎng)為 529nm ；JC-10 聚合物的大激發(fā)波長(zhǎng)為585nm ，大發(fā)射波長(zhǎng)為 590nm 。實(shí)際觀察時(shí)，使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設(shè)置即可。
    本試劑盒提供了 CCCP 作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)于六孔板中的樣品，本試劑盒共可以檢測(cè) 100 個(gè)樣品；對(duì)于 12 孔中的樣品，本試劑盒共可以檢測(cè) 200 個(gè)樣品。
 

操作步驟 ：
1 、JC-10  染色工作液的配制 ：
    六孔板每孔所需 JC-10 染色工作液的量為 1mL ， 其他培養(yǎng)器皿的 JC-10 染色工作液的用量以此類推；對(duì)于細(xì)胞懸液每 50～100 萬(wàn)細(xì)胞需 0.5mL JC-10 染色工作液。取適量 JC-10 （200×），按照每 50µL JC-10（200 ×）加入 8mL 超純水的比例稀釋 JC-10 。劇烈震蕩充分溶解并混勻 JC-10 。然后再加入 2mL JC-10染色緩沖液（5 ×），混勻后即為 JC-10 染色工作液。
2 、 陽(yáng)性對(duì)照的設(shè)置 ：
    把試劑盒中提供的 CCCP（10mM ）推薦按照 1  1000  ∶ 的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，稀釋 10µM ，處理細(xì)胞 20 分鐘。 隨后按照下述方法裝載 JC-10 ， 進(jìn)行線粒體膜電位的檢測(cè)。 對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞， 通常 10µMCCCP 處理 20 分鐘后線粒體的膜電位會(huì)*喪失， JC-10 染色后觀察應(yīng)呈綠色熒光； 而正常的細(xì)胞經(jīng) JC-10染色后應(yīng)顯示紅色熒光。對(duì)于特定的細(xì)胞，CCCP 的作用濃度和作用時(shí)間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料決定。
3 、 對(duì)于懸浮細(xì)胞 ：
   （1）取 10～60 萬(wàn)細(xì)胞，重懸于 0.5mL 細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。
   （2）加入 0.5mL JC-10 染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37 ℃孵育 20 分鐘。
   （3）在孵育期間，按照每 1mL JC-10 染色緩沖液（5×）加入 4mL 蒸餾水的比例，配制適量的 JC-10 染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。
   （4）37℃孵育結(jié)束后，600g 4 ℃離心 3～4 分鐘，沉淀細(xì)胞。棄上清，注意盡量不要吸除細(xì)胞。
   （5） 用 JC-10 染色緩沖液 （1×）洗滌 2 次： 加入 1mL JC-10 染色緩沖液 （1×） 重懸細(xì)胞， 600g 4 ℃離心 3～4 分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。再加入 1mL JC-10 染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，600g 4 ℃離心 3～4 分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。
   （6）再用適量 JC-10 染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)或流式細(xì)胞儀分析。
4 、 對(duì)于貼壁細(xì)胞 ：
   注意：對(duì)于貼壁細(xì)胞，如果希望采用熒光分光光度計(jì)或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，可以先收集細(xì)胞，重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測(cè)方法。
   （1）對(duì)于六孔板的一個(gè)孔，吸除培養(yǎng)液，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)如有必要可以用 PBS 或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一次，加入 1mL 細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。
   （2）加入 1mL JC-10 染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37℃孵育 20 分鐘。
   （3）在孵育期間，按照每 1mL JC-10 染色緩沖液（5×）加入 4mL 蒸餾水的比例，配制適量的 JC-10 染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。
   （4）37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用 JC-10 染色緩沖液（1×）洗滌 2 次。
   （5）加入 2mL 細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。
   （6）熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。
5 、 對(duì)于純化的線粒體 ：
   （1）把配制好的 JC-10 染色工作液再用 JC-10 染色緩沖液（1×）稀釋 5 倍。
   （2）0.9mL 5 倍稀釋的 JC-10 染色工作液中加入 0.1mL 總蛋白量為 10～100 µg 純化的線粒體。
   （3）用熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：混勻后直接用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行時(shí)間掃描（time scan），激發(fā)波長(zhǎng)為 485nm ，發(fā)射波長(zhǎng)為 590nm 。如果使用熒光酶標(biāo)儀，激發(fā)波長(zhǎng)不能設(shè)置為 485nm 時(shí)，可以在475～520nm 范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)。另外，也可以參考下面步驟 6 中的波長(zhǎng)設(shè)置進(jìn)行熒光檢測(cè)。
   （4）用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟 6 。
6 、 熒光觀測(cè)和結(jié)果分析 ：
    檢測(cè) JC-10 單體時(shí)可以把激發(fā)光設(shè)置為 490nm ，發(fā)射光設(shè)置為 530nm ；檢測(cè) JC-10 聚合物時(shí)，可以把激發(fā)光設(shè)置為 525nm ，發(fā)射光設(shè)置為 590nm 。
    注意：此處測(cè)定熒光時(shí)不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在大激發(fā)波長(zhǎng)和大發(fā)射波長(zhǎng)。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測(cè) JC-10 單體時(shí)可以參考觀察其它綠色熒光時(shí)的設(shè)置，如觀察 GFP 或 FITC 時(shí)的設(shè)置；檢測(cè)JC-10 聚合物時(shí)可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或 Cy3 時(shí)的設(shè)置。出現(xiàn)綠色熒光說(shuō)明線粒體膜電位下降，并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說(shuō)明線粒體膜電位比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。
 

注意事項(xiàng) ：
   （1）JC-10 （200×）在 4 ℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以 20～25℃水浴溫育片刻全部融解后使用。
   （2） 必須先把 JC-10 （200×） 用試劑盒提供的超純水充分溶解混勻后， 才可以加入 JC-10 染色緩沖液 （5×） 。不可先配制 JC-10 染色緩沖液（1×）再加入 JC-10（200×），這樣 JC-10 會(huì)很難充分溶解，會(huì)嚴(yán)重影響后續(xù)的檢測(cè)。
   （3）裝載完 JC-10 后用 JC-10 染色緩沖液（1×）洗滌時(shí)，使 JC-10 染色緩沖液（1×）保持 4 ℃左右，此時(shí)的洗滌效果較好。
   （4）JC-10 探針裝載完并洗滌后盡量在 30 分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測(cè)。在檢測(cè)前需冰浴保存。
   （5）請(qǐng)勿把 JC-10 染色緩沖液（5×）全部配制成 JC-10 染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過(guò)程中需直接使用 JC-10 染色緩沖液（5×）。
   （6）如果發(fā)現(xiàn) JC-10 染色緩沖液（5×）中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進(jìn)溶解可以在 37℃加熱。
   （7）CCCP 為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請(qǐng)注意小心防護(hù)。
   （8）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

相關(guān)文獻(xiàn)： 

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《白頭翁湯正丁醇提取物誘導(dǎo)白念珠菌生物被膜細(xì)胞凋亡》 作者:施高翔， 汪云霞， 馮鑫， 邵菁， 汪天明 期刊:中國(guó)真菌學(xué)報(bào) 影響因子:0.576 PMID:
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《A cold-water soluble polysaccharide isolated from Grifola frondosa induces the apoptosis of HepG2 cells through mitochondrial passway》 作者:PeiChenHui-PingLiuHai-HuJiNa-XinSunYing-YingFeng 期刊:International Journal of Biological Macromolecules 影響因子:4.784 PMID:30236758