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PCR純化Kit
貨號：D6492-01
規(guī)格：100/盒
品牌：omega

     聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增十萬乃百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚一個細(xì)胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時便可完成。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。

    PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性→退火→延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性→退火→延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需 2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

PCR反應(yīng)體系：
    1、引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。引物濃度一般為0.1～0.5μM，這一引物濃度足以使1kb的DNA片段在PCR反應(yīng)體系中循環(huán)擴增30T。以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會，但濃度過低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過低。

    2、Taq酶：目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，但保真度較差，在復(fù)制比較長的模板時容易發(fā)生點突變。另一種為在大腸桿菌合成的基因工程酶。能催化以DNA單鏈為模板，以堿基互補原則為基礎(chǔ)，按5’→3’方向逐個將dNTP分子連接到引物的3’端，合成一條與模板DNA互補的新的DNA子鏈。無3’→5’的外切酶活性，沒有校正功能。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶用量一般為0.5～5U/100μl，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。

    3、dNTP：dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系。多次凍融會使dNTP降解，一般存儲濃度為10mM，小量分裝，-20℃冷凍保存。在PCR反應(yīng)中，dNTP濃度一般為50～200μM，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。高濃度dNTP可加速反應(yīng)，但同時會增加錯誤摻入和實驗成本；低濃度dNTP可提高PCR的性，但反應(yīng)速度和PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量會降低。dNTP能與Mg 2+ 結(jié)合，使游離的Mg 2+ 濃度降低。

    4、模板：就模板而言，影響PCR的主要指模板的數(shù)量和純度。一般PCR反應(yīng)中模板的數(shù)量為10 2 ～10 5 個拷貝，靈敏的PCR甚可從一個細(xì)胞、一根頭發(fā)、一個孢子或一個精子提取的DNA中分析目的序列。模板的純度一般要求不是很高，某些擴增實驗中甚將裂解液直接作為PCR模板。但模板中不能有影響擴增反應(yīng)的物質(zhì)存在，如蛋白酶、核酸酶、尿素、SDS、EDTA、卟啉類物質(zhì)等，上述物質(zhì)的存在會影響擴增效果，甚使擴增失敗。模板DNA的量不能太高，否則擴增可能不會成功，在此情況下可適當(dāng)稀釋模板。一般對于單拷貝的哺乳動物基因組模板來說，100ul的反應(yīng)體系中有100ng的模板已足夠。

    5、Mg 2+ ：Mg 2+ 濃度對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響。一般PCR反應(yīng)中，當(dāng)dNTP濃度為200μM時，Mg 2+ 濃度為1.5～2.0mM為宜。Mg 2+ 濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，Mg 2+ 濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。此外，Mg 2+濃度還影響引物的退火、模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度、產(chǎn)物的特異性、引物二聚體的生成等。

PCR反應(yīng)條件：
    1、變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不*是導(dǎo)致PCR失敗的主要原因。一般情況下，93℃～94℃/min足以使模板DNA變性，若低于93℃則 需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物*變性，就會導(dǎo)致PCR失敗。
    2、退火溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇適退火溫度的起點較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
   復(fù)性溫度=Tm值－(5～10℃)
   在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為30～60秒，足以使引物與模板之間*結(jié)合。
    3、延伸溫度與時間：PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min是足夠的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸15min。延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。
    4、循環(huán)次數(shù)：循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40T之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。

PCR純化Kit訂購說明：

1、絕大部分產(chǎn)品備有現(xiàn)貨，一般情況下都能訂貨當(dāng)日發(fā)貨。 
2、部分非常用產(chǎn)品，需提前1－2日預(yù)訂，海外期貨則需要提前3-6周預(yù)訂。 
3、部分產(chǎn)品價格會因貨期、批次等因素發(fā)生變化，若有變動以訂貨當(dāng)日新價格為準(zhǔn)。 
4、每日訂單截止時間為16點整，部分城市可到17點整，因超過截止時間造成當(dāng)日不能發(fā)貨的將于次日安排發(fā)貨。
5、請辦理完貨款后，將收據(jù)、底單等連同收貨人的地址、姓名、等以傳真、、短信、等形式通知我們。

運輸說明：

1、極低溫產(chǎn)品：極低溫產(chǎn)品運輸過程中加裝干冰運輸。用干冰把產(chǎn)品包裹起來，再用泡沫盒密封，膠帶層層粘住泡沫盒，放入索萊寶的箱子，然后交付給合作快遞，安全快速高效放心的送客戶的手中，保證產(chǎn)品的性質(zhì)穩(wěn)定如一，為您的實驗保駕護(hù)航。
2、低溫產(chǎn)品：低溫產(chǎn)品運輸過程中加裝索萊寶冰袋運輸。事先用冰袋把產(chǎn)品包裹起來，再使用泡沫盒密封，用膠帶嚴(yán)實密封泡沫盒，再放入索萊寶的箱子（保溫效果少可以持續(xù)一周），然后交付給合作快遞，安全快速高效放心的送客戶的手中，保證產(chǎn)品的性質(zhì)穩(wěn)定如一，為您的實驗保駕護(hù)航。
3、常溫產(chǎn)品：常溫產(chǎn)品運輸過程中無需加冰或者特殊包裝。產(chǎn)品由公司庫房人員快速配貨，準(zhǔn)確快速高效的快遞保證產(chǎn)品快速送達(dá)您的手中。