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Mouse IL-6 ELISA KIT目       錄

背景介紹………………………………………………………………………………

檢測原理………………………………………………………………………………

注意事項………………………………………………………………………………

安全提示………………………………………………………………………………

試劑盒組成及儲存……………………………………………………………………

自備實驗器材…………………………………………………………………………

樣品收集及儲存………………………………………………………………………

試劑準備………………………………………………………………………………

檢測步驟………………………………………………………………………………

結果判斷………………………………………………………………………………

參數表征………………………………………………………………………………

參考文獻………………………………………………………………………………

常見問題分析及解決辦法……………………………………………………………

Mouse IL-6 ELISA KIT背景介紹：

白細胞介素-6（IL-6）是由纖維母細胞、單核/巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、上皮細胞、角質細胞、以及多種瘤細胞所產生。IL-1、TNF-a, PDGF、病毒感染、雙鏈RNA及c AMP等，均可誘導正常細胞產生白介素6。白介素6能夠刺激參與免疫反應的細胞增殖、分化并提高其功能。IL-6由2條糖蛋白鏈組成；1條為α鏈，分子量80KD；另1條為β鏈，分子量130KD。α鏈缺少胞內區(qū)，只能以低親合性與IL-6結合，所形成的復合物迅即與高親和性的β鏈結合，通過β鏈向細胞內傳遞信息。IL-6主要有以下生物特性：誘導B細胞分化；支持漿細胞瘤和骨髓瘤增生；誘導IL-2和IL-2受體表達；誘導單核細胞分化；誘導CTL；增強NK細胞活性；誘導急性期反應分子并刺激肝細胞；誘導神經元分化；誘導腎小球膜細胞生長；誘導角質化細胞生長。

檢測原理：

    Solarbio (Solarbio ®)ELISA試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯免疫吸附檢測技術。將抗小鼠IL-6單克隆抗體包被在酶標板上；分別加入梯度稀釋的標準品和預稀釋的樣本，標準品和樣本中的小鼠IL-6會與酶標板上的包被抗體充分結合；洗板后加入生物素化抗小鼠IL-6抗體，該抗體會與板子上包被抗體捕獲的標準品和樣本中的小鼠IL-6發(fā)生特異性結合；洗板后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會發(fā)生高強度的非共價結合；洗板后加入顯色劑底物TMB，若反應孔中樣品存在不同濃度的小鼠IL-6，則HRP會使無色TMB變成不同深淺（正相關）的藍色物質，加入終止液后反應孔會變成黃色；后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定反應孔樣品吸光度（OD），樣本中的小鼠IL-6濃度與OD成正比，通過繪制標準曲線和四參數擬合軟件便可計算出樣本中小鼠IL-6的濃度。

注意事項：※※※

1. 試劑盒應在有效期內使用，請不要使用過期的試劑。

2. 試劑盒未使用時應保存在2-8℃冰箱，已復溶但未用完的標準品，請丟棄。

3. 試劑盒使用前請在室溫恢復30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。

4. 在試驗中標準品和樣本建議作復孔檢測，且加入試劑的順序應保持*。

5. 為避免交叉污染，請在試驗中使用1次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。.

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶 

蓋上，使用前請離心處理（5-10 S即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹打幾次。

7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內含的 試劑代替本試劑盒中的某單個組分。

8. 為保證結果準確，每次檢測均需做標準曲線。

安全提示：試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護；在操作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物實驗室安全防護有關管理規(guī)定執(zhí)行。

試劑盒組成及儲存：

自備實驗器材（不提供，可代購）

1． 酶標儀（主波長450nm，參考波長630nm）

2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl

3． 洗板機或洗瓶

4． 37℃孵育箱

5． 雙蒸水，去離子水，量筒等

6． 稀釋用聚丙烯試管

樣本收集及儲存：

1. 細胞培養(yǎng)上清：

將細胞培養(yǎng)基移無菌離心管，在4℃條件下1000×g離心10 min,然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內檢測可放入2-8℃儲存），避免反復凍融。

2. 血清樣本：

室溫血液自然凝固20 min后，在4℃條件下1000×g離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內檢測可放入2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復凍融。

3. 血漿樣本：

將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據標本的實際要求選擇EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合20 min，在4℃條件下1000×g離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內檢測可放入2-8℃儲存），避免反復凍融。

※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高于標準品的高值，請將樣品做適當倍數稀釋后檢測，建議正式實驗前做預實驗以確定稀釋倍數。

試劑準備：

1. 試劑回溫：先在實驗前30 min將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現結晶，請放入37℃溫浴直到結晶全部溶解。

2. 配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將20倍濃縮洗滌液稀釋成1倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放入4℃冰箱保存。

3. 標準品梯度稀釋：加入標準品/樣本稀釋液（SR1）1ml凍干標準品中，靜置15分鐘待其*溶解后輕輕混勻(濃度為1000pg/ml)，用移液器吸出溶解好的標準品原液250ul,加入750ul標準品/樣本稀釋液（SR1）(濃度為250pg/ml)，然后按照以下濃度：250、125、62.5、31.25、15.625、7.8、3.9、 0 pg/ml進行稀釋。復溶過的標準品原液（1000pg/ml）未用完的應廢棄或根據需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。

4. 生物素化抗體工作液：預先計算好試驗所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應用工作液（稀釋前充分混勻），請在30分鐘內加入到反應孔中。

生物素化抗體工作液具體稀釋方法如下：

5. 酶結合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結合物稀釋成1倍應用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘內使用。

酶結合物工作液具體稀釋方法如下：

6. 洗滌方法：

l 自動洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為300ul/孔,注與吸出間隔為30秒，洗板5次。

l 手工洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液300ul/孔，靜止30秒后甩凈酶標板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板5次。

結果判斷：

1.用酶標儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進行雙波長檢測，請用 450 nm 的OD測定值減去630 nm的OD測定值。

2.計算標準品、樣品的平均OD值：每個標準品和標本的OD值應減去零孔的OD值

3.以標準品濃度為橫坐標，吸光度OD值為縱坐標，用軟件繪制標準曲線，樣品中IL-6含量可通過對應OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

4.若標本OD值高于標準曲線上限，應做適當稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數。

參數表征：

1. 數據及標準曲線

本圖僅供參考，應以當次試驗標準品繪制的標準曲線計算小鼠IL-6的樣本含量

2. 靈敏度：

低可檢測小鼠IL-6濃度達2pg/ml，

20個零標準品濃度OD的平均值加上兩個標準差，計算相應的可檢測濃度。

3. 特異性：

不與小鼠CT-1、 gp130、 IL-11、 LIF反應，人的IL-6、IL-6 sR 等反應

4. 重復性：

板內，板間變異系數<10%

5. 回收率：

在選取的健康小鼠血漿、細胞培養(yǎng)上清中加入 3 個不同濃度水平的小鼠 IL-6，計算回收率。

6. 線性稀釋：

分別在選取的4 份健康小鼠血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入高濃度小鼠 IL-6，在標準曲線動力學范圍內進行稀釋，評估線性。