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教你成為平淡無奇的WB實驗小能手—樣本制備篇

閱讀:679      發(fā)布時間:2024-1-24
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蛋白質(zhì)印跡(Western Blot, WB)又稱為免疫印跡(Immunoblot),是利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將樣品中分子量大小不同的蛋白分開,然后通過電轉(zhuǎn)移的方法將凝膠中的蛋白定量地遷移并幾乎原位復制、固定到固相膜上,再利用抗原、抗體的特異性結(jié)合反應,特殊的抗體標記技術以及相應的檢測方法,進而對目的蛋白進行定性、相對定量檢測的技術。此項技術誕生于上世紀七十年代,近半個世紀以來經(jīng)久不衰。

WB實驗流程分為樣本采集,蛋白樣品制備,上樣,凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗孵育,洗膜,二抗孵育,洗膜,顯色(信號檢測)。作為一名實驗汪是不是最近又虐到體無完膚?今天來和大家聊聊應用廣泛幾乎人人都曾中槍的Western Blot實驗—樣本采集和蛋白制備的相關知識和技巧。




一、樣本采集和保存

1. 對于動物組織和植物器官,樣本較多或取樣時間間隔太長則需先將樣本放入液氮速凍冷存;若未能及時進行蛋白樣品制備,可液氮速凍后,存入-80℃保存約六個月或浸入液氮罐保存約一年。

2. 對于細胞和一些微生物樣本,可去除培養(yǎng)基后,加裂解液制備蛋白樣品;若未能及時制備蛋白樣品,去除培養(yǎng)基后,將其液氮速凍后保存于-80℃(約一個月)或保存于液氮(約三個月)。

3. 所有樣本均不建議保存于-20℃。-20℃時,組織、細胞內(nèi)的水會結(jié)晶,細胞活性和組織微觀結(jié)構會受到傷害,生物大分子受到組織、細胞內(nèi)多種因素的影響,穩(wěn)定性可能會降低。


二、蛋白提取

一般為了提取到足夠的蛋白以及更容易地提取蛋白,需要準備足夠量的樣本,要求樣本量為細胞>106個,組織>30mg,菌體濕重>10mg,植物>100mg,血清>50µL。蛋白提取的原則:低溫快速,裂解充分。

下面對一些常用樣本的蛋白提取過程進行簡單描述:

1. 細胞樣本

一般樣本為1×106~1×107個細胞,根據(jù)細胞量多少或不同細胞中蛋白含量的多少所加裂解液的量也不相同,一般1×106個細胞,加裂解緩沖液100~200µL,具體實驗操作時參照以上比例,可進行適當調(diào)整。

1) 懸浮細胞:收集培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的細胞,4℃條件下1000~3000rpm,離心3~5min,留下細胞沉淀,去除細胞培養(yǎng)基,然后用預冷的0.01M PBS(即1×PBS)輕洗2次,4℃條件下1000~3000rpm,離心3~5min,去除上清,取用細胞沉淀,按照上述參考比例加入適量裂解緩沖液,吹打混勻,冰上裂解15~30min。

2) 貼壁細胞:直接去除培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,用預冷的1×PBS輕洗2次,去除PBS,加入適量裂解緩沖,用細胞刮刮下細胞,連同裂解緩沖液一起收集,吹打混勻,冰上裂解15~30min?;蛘哌€有一種方法是直接用細胞刮刮下細胞,連同培養(yǎng)基一起收集,后續(xù)過程同懸浮細胞;再有一種方法,是用胰酶消化細胞后,收集細胞,離心沉淀,用預冷的PBS輕洗細胞沉淀,后續(xù)過程同懸浮細胞,但胰(蛋白)酶消化的方法不適用于目的蛋白為細胞膜上的膜蛋白,會造成影響

2. 組織樣本

一般動物組織樣本,按照1mg組織加入10µL裂解液的比例進行添加,不同的組織蛋白含量也不同,需要調(diào)整添加量。去除組織樣本上的脂肪(可用預冷的眼科剪、鑷子去除)、血液(用預冷的PBS清洗)等雜質(zhì),防止造成污染,產(chǎn)生干擾。然后對處理好的樣本,加入裂解緩沖液,用預冷的眼科剪在冰上將其剪碎,可以加入鋼珠后,高速振蕩研磨儀進行破碎。對于骨、肌肉、皮膚、尾巴、韌帶組織等或硬度大或韌性強的樣本,可以先試著剪碎,再進行液氮研磨后加入適量裂解液。組織樣本處理后,冰上放置15~30min。

3. 冰上放置裂解的同時,需要加入適量蛋白酶抑制劑來減少蛋白酶的水解作用,磷酸化蛋白的提取還需要加入蛋白磷酸酶抑制劑。

4. 冰上放置裂解后,建議再進行超聲處理,經(jīng)過超聲處理,裂解更充分。

5. 如有特殊的樣本或者特殊的目的蛋白,常規(guī)方法難以提取,建議查閱相關文獻,參照文獻上的配方和步驟提?。蝗糇詈笪凑业较嚓P資料,可購買商品化的試劑盒。


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