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Millipore的Amicon®Ultra超濾管的使用方法
閱讀：3010 發(fā)布時(shí)間：2023-11-15默克 Millipore Amicon® Ultra 離心式超濾管因其wan美的設(shè)計(jì)一經(jīng)推出即成為生物樣品操作的產(chǎn)品。不論是蛋白、核酸、病毒或顆粒物，抑或低濃度樣品或?qū)氋F的活性樣品，Amicon® Ultra 都能兼顧高回收率和操作的方便性及標(biāo)準(zhǔn)化，并滿(mǎn)足下游各種應(yīng)用的要求，使研究者處理樣品時(shí)倍感輕松。但是，在默克生命科學(xué)團(tuán)隊(duì)推出超濾管中文說(shuō)明書(shū)(AU0.5/4/15)之前，我們發(fā)現(xiàn)近90%的使用者在選擇和使用過(guò)程中因?yàn)槿狈Ρ匾畔⒍鴽](méi)有獲得最佳體驗(yàn)，更重要的是，寶貴的樣本會(huì)遭受本可避免的損失！
選對(duì)截留分子量，事半功倍
如果目的蛋白是120kDa，請(qǐng)問(wèn)應(yīng)該選擇的超濾管規(guī)格是100k，50k，還是30k甚至10k？你采用的是1/2，1/3抑或1/6算法？這些沒(méi)有統(tǒng)一的說(shuō)法，是因?yàn)椴煌瑥S家的膜的截留分子量的定義不同。Millipore的超濾管采用其有的再生纖維素膜，定義為：一個(gè)確定NMWL 的超濾膜應(yīng)該截留至少90% 以上的這個(gè)大小的球形分子，即100kDa的球形蛋白用100k的Ultracel®再生纖維素膜得率超過(guò)90%。請(qǐng)仔細(xì)查看以下默克生命科學(xué)數(shù)據(jù)：
(以0.5mL的AU0.5為例，其它型號(hào)截留分子量的選擇原則一致，具體離心力和離心時(shí)間不同。)
截留分子量選小啦！看到這個(gè)表，你是否發(fā)現(xiàn)原來(lái)抱怨Millipore超濾管流速偏慢的根源來(lái)自對(duì)于Millipore截留分子量定義的誤解。膜孔徑要小于目的分子這是第一原則。如果分子有近似球形的立體結(jié)構(gòu)(而非明顯的線(xiàn)性分子)，在Millipore再生纖維素超濾膜體系內(nèi)，選擇“等于"或“略小于"目的分子的截留分子量的超濾管是zui選擇，這樣操作起來(lái)又快又好，既保證了樣品回收率，又縮短了離心時(shí)間，大幅降低大分子損傷風(fēng)險(xiǎn)。
Amicon® Ultra系列超濾管產(chǎn)品需要根據(jù)起始樣品體積、目標(biāo)蛋白或核酸的分子量、終體積及濃縮倍數(shù)等選擇具體型號(hào)。下表為選擇適合截留分子量的超濾管提供了一些參考建議。
收取體積已經(jīng)很小的濃縮好的樣品時(shí)，你會(huì)：
A 購(gòu)買(mǎi)最尖細(xì)的槍頭，把樣品吸回來(lái)
B 濃縮倍數(shù)低一點(diǎn)，以便用槍頭把樣品吸回來(lái)
C 反轉(zhuǎn)離心回收，獲得最高得率
正確答案“C",你答對(duì)了么？
Millipore的Amicon® Ultra系列超濾管上樣體積有0.5/2/4/15/70mL等五種，除了采用低吸附的管材和低蛋白吸附的再生纖維素超濾膜，其中0.5mL，2mL和70mL的規(guī)格還特別設(shè)計(jì)了反轉(zhuǎn)回收模式，以便使已經(jīng)濃縮的樣品回收。
現(xiàn)在你總該知道為什么收到AU0.5的時(shí)候會(huì)有兩個(gè)外管了吧～
更多關(guān)于超濾管的正確使用問(wèn)題：
蛋白在濃縮時(shí)出現(xiàn)了沉淀，如何改進(jìn)？
蛋白如果濃縮過(guò)快或者過(guò)度濃縮都有可能引起蛋白沉淀。建議蛋白濃縮后的最終濃度不超過(guò)20mg/ml。對(duì)于對(duì)濃縮速度敏感而容易沉淀的蛋白，建議的改進(jìn)方法是：
1）離心力降為推薦離心力的30%-50%
2）改用截留分子量更大的超濾管（如原本選用10k，此時(shí)可以選擇30k）
3）在濃縮過(guò)程中取出超濾管，用槍頭反復(fù)吹吸幾次后再繼續(xù)濃縮
4）體積較大的樣品可考慮選用攪拌式超濾杯，減少沉淀的發(fā)生。
Amicon® Ultra超濾管可以用酒精消毒滅菌么？
Amicon® Ultra與70%乙醇是兼容的，但是對(duì)滅菌處理的具體方法沒(méi)有做相關(guān)的測(cè)試，所以無(wú)法提供更進(jìn)一步的參考信息。建議采用Ultrafree無(wú)菌離心管對(duì)濃縮后的樣品進(jìn)行過(guò)濾除菌。
Amicon® Ultra超濾裝置是否可以用于高壓滅菌？
Amicon® Ultra都是采用熱封設(shè)計(jì)，不可以用高壓高溫滅菌。
懷疑濃縮過(guò)程中目的蛋白和超濾膜之間可能存在非特異性吸附，如何改善？
Amicon® Ultra超濾管使用的是再生纖維素膜，這種材質(zhì)是蛋白吸附的超濾膜。但是對(duì)于一些疏水性蛋白或非極性蛋白，它們和膜的非特異吸附可能會(huì)增強(qiáng)。對(duì)于這種情況，可以嘗試在實(shí)驗(yàn)前對(duì)超濾管進(jìn)行封閉處理，也可以嘗試換成Amicon® Ultra 0.5或2來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)減小膜面積來(lái)降低非特異性吸附。
有時(shí)候用超濾離心管連水都離不下來(lái)，可能是什么原因？
Amicon® Ultra超濾膜中含有微量甘油。如果出現(xiàn)這種情況，請(qǐng)先用0.1 N NaOH清洗再離心。最后用緩沖液或Milli-Q®水再次清洗后甩干。清洗后的濾膜應(yīng)立即使用，如暫時(shí)不用，請(qǐng)保持潤(rùn)濕狀態(tài)，避免重新干燥。
如果要用超濾的方法分離兩種蛋白，那么這兩個(gè)蛋白的大小需要相差多少？
按照經(jīng)驗(yàn)，建議兩個(gè)蛋白的分子量要相差一個(gè)數(shù)量級(jí)（10倍）。
說(shuō)明書(shū)中推薦在室溫下進(jìn)行離心，考慮到蛋白的穩(wěn)定性，是否可以在4℃進(jìn)行離心？
可以，但是低溫會(huì)增加蛋白樣品的粘性，導(dǎo)致流速減慢，建議可將離心時(shí)間延長(zhǎng)到原來(lái)的1.5倍。
濃縮后發(fā)現(xiàn)濃縮液中沒(méi)有目的蛋白，可能的原因有哪些？
首先，Amicon® Ultra超濾管的蛋白zui低起始濃度為25ug/ml。請(qǐng)確保樣本的起始濃度大于這個(gè)濃度。其次，如果問(wèn)題仍然出現(xiàn)，請(qǐng)不要丟棄樣本濾過(guò)液以便用于分析可能的原因：
1）如果目的樣本在濾過(guò)液中，那么請(qǐng)排查：
a） 是否選擇了合適截留分子量的超濾管（目的蛋白分子量的1/2或者1/3）？
b）使用的離心力是否是在限定范圍內(nèi)？如果使用的是rpm，請(qǐng)換算成相應(yīng)的g離心力，具體換算方法請(qǐng)垂詢(xún)。
c）離心機(jī)最近是否有校準(zhǔn)過(guò)？
d）是否嘗試這個(gè)蛋白？如果能確保用同樣的超濾管對(duì)其它蛋白成功操作的話(huà)，那么有可能是這個(gè)目的蛋白的原因。有時(shí)蛋白會(huì)因其本身的一些特性（構(gòu)象差異）而影響濃縮效果，建議選用更小截留分子量的超濾管（如原本選用30k，此時(shí)可以選擇10k）
2）如果目的樣本也不在濾過(guò)液中，那么：
a）蛋白樣本起始濃度是否大于25ug/mL？
b）用來(lái)確定樣本濃度的方法是什么？是否可信？
c）目的蛋白是不是沉淀了？如果是，具體解決方法請(qǐng)參考上面的關(guān)于蛋白沉淀問(wèn)題的解釋。