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拓赫機電科技(上海)有限公司

傷口愈合/細胞劃痕實驗新方法-如何劃出筆直均一的劃痕

時間:2016-3-31閱讀:6427
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前言

     傷口愈合實驗是體外研究細胞遷移的一個有用的實驗。原理是人為的在鋪板的單層細胞中制造一個空白的無細胞的地帶,然后對這個無細胞地帶的邊緣的細胞進行觀察;這些邊緣的細胞會開始進行遷移活動,并且終覆蓋整個無細胞的區(qū)域,重新互相接觸在一起。

傳統(tǒng)實驗方法

     細胞在培養(yǎng)皿內(nèi)貼壁后,使用移液槍的槍頭在貼壁細胞的中間劃過,人為造成一道傷口(劃痕),之后定時測量劃痕的寬度,進而得到傷口愈合的細胞遷移數(shù)據(jù)。

實驗缺點:

1.手動劃痕,不能保證每次劃痕的一致;

2.有時候在劃細胞的同時會刮壞一片細胞,對劃痕的邊緣的細胞造成機械損傷;

3.如果培養(yǎng)皿底部還有包被蛋白的話,槍頭劃過,很可能傷害到包被,進而影響到細胞遷移,結(jié)果便很難判斷是哪個因素造成了決定性的影響。

4.定時測量劃痕的寬度,計算劃痕寬度隨時間推移的變化;在選取劃痕測量點時,不可避免地引入了主觀誤差(人為選取了遷移結(jié)果符合實驗預(yù)期的點);

  綜上,傳統(tǒng)的傷口愈合方法總是重復(fù)性不佳,對于實驗結(jié)果的闡述說服力不足。

       下面分享一種新方法,輕松得到筆直均一的劃痕!

實驗核心

       使用傷口愈合插件制造筆直均一的劃痕(圖一)。

實驗方法     

  1. 實驗材料
  • 細胞:     MCF-7 (ATCC: HTB-22; DSMZ: ACC115)
  • 實驗耗材:   ibidi 35 mm培養(yǎng)皿帶傷口愈合插件(ibidi, 81176) ibiTreat
  • 細胞培養(yǎng)基:  RPMI (Sigma, R8758) + 10% FCS (Sigma, F0804)
  • 細胞消化試劑:  Trypsin-ETDA (Sigma, 59418C)
  • 滅菌鑷子
  • 倒置顯微鏡,如果需要進行連續(xù)的觀測好搭配鏡載加熱孵育系統(tǒng)

 

  1. 實驗步驟
  1. 鋪細胞(圖

為了獲得更好的實驗結(jié)果,在做實驗之前好進行一次預(yù)實驗,以確定需要使用的細胞懸液的密度。我們建議,好將細胞懸液密度調(diào)整為24小時后正好可以長滿每個插件的小孔。

  • ibidi傷口愈合培養(yǎng)皿底部的保護膠帶撕除。
  • 準備細胞懸液,調(diào)整懸液濃度為3*10cells/ml,這樣24小時后,細胞能剛剛長滿單個小孔。
  • ibidi細胞插件的每孔中加入70μl的細胞懸液。注意不要大力晃動培養(yǎng)皿。以防止細胞不均勻。
  • 37C培養(yǎng)箱中孵育24小時。

 

 

A. 去除培養(yǎng)皿底部的保護膠帶。B.C.ibidi傷口愈合插件中加入細胞。

 

  1. 形成劃痕

當所有細胞都貼壁并且剛剛長滿的時候,就可以開始傷口愈合實驗了。用鑷子將傷口愈合插件提出,之后加入新鮮的培養(yǎng)基,或者在培養(yǎng)基中加入刺激劑,然后觀察傷口愈合的情況。

  • 24小時后對細胞前一天種的細胞做鏡檢。細胞要貼壁并且是剛剛長滿每個孔。長得過多移除插件時會帶走很多細胞,長得過少,傷口愈合的效果很差。
  • 如圖所示,小心的用鑷子夾住插件的一個角,將插件移除。 

           

圖三:用鑷子移除插件

  • 移除插件后,要用顯微鏡檢查是否形成合格的劃痕(圖)。
  • 小心的清洗細胞,之后加入2ml培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

 

圖四 筆直均一的劃痕

 

  1. 采集并分析圖像

一般傷口愈合實驗都是采集一張劃痕的初始圖像,再在實驗結(jié)束時候采集一張劃痕愈合的圖像。我們建議可以在這個過程多做幾個時間點,這樣可以觀測到細胞遷移隨時間的變化特征。

  • 在顯微鏡下選取能同時看到劃痕和兩邊細胞的視野進行成像,劃痕的方向好在視野內(nèi)為水平或者垂直
  • MCF-7細胞每半小時采集一張圖片,一直持續(xù)到20小時。
  • 采用ibidi傷口愈合分析軟件,統(tǒng)計細胞的覆蓋面積,做出曲線圖,可以看到在大約11個小時的時候,細胞基本就已經(jīng)長滿了,接下來幾個小時細胞覆蓋面積都不會發(fā)生變化(圖)。

 

圖五(a)  顯微鏡下觀察細胞覆蓋面積的變化

 

圖五(b)  細胞覆蓋面積的數(shù)據(jù)統(tǒng)計

 

 

實驗總結(jié)對比

1.本實驗方法能得到重復(fù)性更好的劃痕(圖六);

圖六 通過計算劃痕的面積可以看出,在多次實驗中,槍頭劃痕(左圖)

制造的劃痕面積數(shù)據(jù)波動大,重復(fù)性差;ibidi傷口愈合插件(右圖)制造的劃痕面積數(shù)據(jù)統(tǒng)一,重復(fù)性良好

2.不會刮壞細胞,也不會造成劃痕的邊緣的細胞機械損傷;

3.不會傷害到培養(yǎng)皿底部包被蛋白;

 

圖一:左圖表示槍頭劃過后,底部包被蛋白被劃傷,細胞遷移結(jié)果受到底部不均一的影響。右圖ibidi插件移除后底部的包被蛋白沒有被破壞。

 

4.通過計算細胞覆蓋面積得出細胞遷移結(jié)果,避免人為選取測量點,使數(shù)據(jù)更客觀。1天內(nèi)就能得到測量結(jié)果,實驗分析更快更準確。

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