14
白介素5受體（可溶性）ELISA KIT
白介素5受體（可溶性）ELISA KIT是用于定量檢測生物樣本中可溶性白介素 5 受體含量的工具，在科研領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，有助于深入了解免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等生理病理過程。以下從多方面為你介紹：
檢測原理：運用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)。試劑盒的酶聯(lián)板預(yù)先包被了針對可溶性白介素 5 受體的特異性抗體。當加入樣本后，樣本中的可溶性白介素 5 受體與固相抗體特異性結(jié)合。接著加入酶標記的抗可溶性白介素 5 受體抗體，其與已結(jié)合在固相抗體上的受體形成 “固相抗體 - 可溶性白介素 5 受體 - 酶標抗體" 復(fù)合物。經(jīng)過充分洗滌，去除未結(jié)合的物質(zhì)，然后加入底物溶液（如 3,3',5,5'- 四甲基聯(lián)苯胺，即 TMB）。在酶標抗體中酶的催化下，底物發(fā)生顯色反應(yīng)，顏色的深淺與樣本中可溶性白介素 5 受體的含量成正比。通過酶標儀在特定波長（通常為 450nm）下測量吸光度，與標準曲線進行對比，即可計算出樣本中該受體的濃度 。
試劑盒組成
酶聯(lián)板：有 96 孔或 48 孔的規(guī)格，已預(yù)包被抗可溶性白介素 5 受體抗體，是反應(yīng)的載體。
標準品：通常為凍干品，一般配備 2 瓶。臨用前需用標準品稀釋液進行復(fù)溶，并稀釋成不同濃度梯度，例如 0、15.6、31.2、62.5、125、250、500、1000 pg/mL 等，用于繪制標準曲線 。
樣本xi釋液：用于稀釋濃度過高的待測樣本，確保樣本濃度處于試劑盒的有效檢測范圍內(nèi) 。
酶標抗體：即 HRP（辣根過氧化物酶）標記的抗可溶性白介素 5 受體抗體，為濃縮液，使用時需按要求用酶標抗體稀釋液進行稀釋 。
酶標抗體稀釋液：專門用于稀釋酶標抗體 。
底物溶液：如 TMB 底物，可與酶標抗體中的 HRP 發(fā)生反應(yīng)，從而產(chǎn)生顏色變化 。
洗滌液：一般為濃縮液，使用時需按一定比例用蒸餾水或去離子水稀釋，用于洗滌酶聯(lián)板，去除未結(jié)合的物質(zhì)，降低背景干擾 。
終止液：多為強酸溶液（如硫酸），用于終止底物的顯色反應(yīng)，使反應(yīng)液顏色穩(wěn)定，便于讀數(shù) 。
封板膜：在溫育過程中覆蓋酶聯(lián)板，防止液體蒸發(fā)和外界污染 。
使用說明書：詳細介紹試劑盒的使用方法、注意事項、性能指標等 。
樣本要求
血清：采集血液后，室溫放置 2 小時或 4℃過夜，隨后以 1000×g 離心 20 分鐘，取上清備用。采血應(yīng)使用無熱原、無內(nèi)毒素的一次性器材 。
血漿：可用乙二胺四乙酸（EDTA）、肝素等作為抗凝劑。樣本采集后 30 分鐘內(nèi)，在 2 - 8℃下以 1000×g 離心 15 分鐘，取上清 。
細胞培養(yǎng)上清：將細胞培養(yǎng)上清以 1000×g 離心 20 分鐘，去除細胞碎片和雜質(zhì)后，取上清用于檢測 。
組織勻漿：用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01M，pH = 7.4）沖洗組織，去除殘留血液。剪碎組織后，按照約 1:9（w/v）的比例加入 PBS，在冰上充分研磨。再經(jīng) 5000×g 離心 5 - 10 分鐘，取上清用于檢測 。
樣本采集后若短期內(nèi)檢測，可保存于 4℃；若需長時間保存，需置于 - 20℃或 - 80℃凍存，且要避免反復(fù)凍融，溶血樣本一般不適合檢測 。
操作流程
準備工作：從冰箱取出試劑盒，提前 30 分鐘使其平衡至室溫。同時，將濃縮洗滌液按要求比例用蒸餾水或去離子水稀釋備用 。
加樣：設(shè)置空白孔、標準品孔和樣本孔?？瞻卓准尤霕颖緓i釋液，標準品孔加入不同濃度的標準品，樣本孔加入處理好的樣本，每孔加樣量通常為 100μL，輕輕混勻，37℃溫育 90 分鐘 。
洗滌：溫育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液加滿各孔，浸泡 1 - 2 分鐘后甩干，重復(fù)洗滌 5 次，確保che底洗凈未結(jié)合物質(zhì) 。
加酶標抗體：每孔加入 100μL 稀釋好的酶標抗體工作液，37℃溫育 60 分鐘 。
再次洗滌：重復(fù)上述洗滌步驟 。
顯色：每孔加入 90μL 底物溶液，輕輕混勻，37℃避光顯色 15 - 30 分鐘（需根據(jù)實際顯色情況判斷） 。
終止反應(yīng)：每孔加入 50μL 終止液，此時溶液顏色由藍色變?yōu)辄S色 。
讀數(shù)：在加終止液后 15 分鐘內(nèi)，用酶標儀在 450nm 波長處測量各孔的吸光度（OD 值） 。
計算結(jié)果：以標準品濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，繪制標準曲線。根據(jù)樣本的 OD 值從標準曲線中查出對應(yīng)的濃度，若樣本進行了稀釋，需乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，從而得到實際濃度 。
