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上海研謹(jǐn)生物科技有限公司

基因克?。ǐ@得目的基因的方法)

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更新時間:2025-02-18 10:27:40瀏覽次數(shù):1488次

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產(chǎn)地類別 國產(chǎn) 應(yīng)用領(lǐng)域 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè)
提供商: 上海研謹(jǐn)生物
服務(wù)名稱: 基因克隆服務(wù)
規(guī)格: 實(shí)驗服務(wù)
價格: 2000元
收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)/服務(wù)周期/提供結(jié)果:
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基因克隆

 

 

 

一.目的基因的獲得

目的基因是指所要研究或應(yīng)用的基因,也就是將要克隆或表達(dá)的基因。獲得目的基因是分子克隆過程中重要的一步。目前用于獲得目的基因的方法有幾種,如限制性內(nèi)切酶直接分離法、文庫篩選法、體外擴(kuò)增法和人工合成法等,其中限制性內(nèi)切酶法直接分離目的基因和多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 或逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) 體外擴(kuò)增目的DNA--片段是目前常用的方法。

 

()采用限制性酶切法直接分離目的基因

1、從原核基因組中制備原核基因組相對較小,用幾種限制性內(nèi)切酶分別消化原核基因組,或用某種限制性內(nèi)切酶對所要研究的基因組進(jìn)行部分消化,可以得到大小不等的各種片段,其中有些片段就會含有目的基因,將這些片段插入載體中進(jìn)行克隆,經(jīng)過篩選,可以得到所需的目的基因。

2.從真核基因組中制備真核基因組比較大,直接用限制性內(nèi)切酶消化后需要篩選的克隆數(shù)太多,不易操作??梢杂靡环N限制性內(nèi)切酶先消化基因組DNA,產(chǎn)生連續(xù)的DNA--片段,然后電泳分離這些DNA--片段,再用-段特異探針與這些DNA--片段進(jìn)行雜交,在含有特異性模板的區(qū)域就會出現(xiàn)雜交帶,可以初步鑒定基因組中是否含有目的基因。我們也可以將酶切后的基因組DNA--片段全部克隆入適當(dāng)?shù)妮d體中,制成基因組文庫,再用特異性探針與基因組文庫中的不同克隆進(jìn)行雜交,陽性克隆即示克隆到的DNA--片段含有特異基因序列。將陽性克隆測序,用第--個克隆片段的末端分離下一個克隆片段,然后利用DNA--片段間的重疊順序來鑒定其他克隆。這樣一步步走下去,終可得全部基因序列,這種技術(shù)叫做染色體步移(chromosome walking)。

 

(二)采用PCR或RT-PCR方法制備目的基因

1.根據(jù)已發(fā)表的基因序列設(shè)計并合成引物,采用PCR (以基因組DNA為模板)或RT-PCR (以mRNA為模板)從組織或細(xì)胞中獲取目的基因片段用于基因操作,這是實(shí)驗室中常用的獲取已知基因的方法。

2.利用PCR獲取目的基因的一大優(yōu)點(diǎn)就是可以根據(jù)需要在引物序列上設(shè)計適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)起始密碼子或終止密碼子等,或通過人為錯配改變堿基序列(人工突變)對目的基因進(jìn)行有限修飾。對于未知基因,可采取構(gòu)建RT-PCR文庫的方法獲得未知基因:利用mRNA末端poly A序列尾設(shè)計共用引物,將所有mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA.利用各種工具酶在cDNA末端加尾,然后采用一對共用引物擴(kuò)增所有cDNA--片段,將經(jīng)PCR擴(kuò)增后的片段插入到適當(dāng)載體中,構(gòu)建成PCR-CDNA文庫。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可以將表達(dá)水平很低的mRNA擴(kuò)增出來,有利于篩選出表達(dá)豐度低的基因。由于經(jīng)過PCR擴(kuò)增,基因序列的精que確性需要采用其他方法進(jìn)一步確定。

3.還有一個獲得目的基因的方法是利用計算機(jī)技術(shù)進(jìn)行計算機(jī)克隆。即利用GenBank中的基因信息,通過軟件比較不同種屬基因之間的相似性(同源性),利用保守區(qū)序列設(shè)計引物, 再用PCR或RT-PCR從不同種屬或不同組織細(xì)胞中獲取未知的基因片段。這是目前可實(shí)現(xiàn)的一種獲得新基因的捷徑。

(三)基因組文庫或cDNA文庫的構(gòu)建和篩選

1.將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶消化后插入到適當(dāng)載體中,得到含有不同插入片段的克隆載體,這種克隆載體的混合物含有長短不同的基因組片段,這就是基因文庫。若將細(xì)胞內(nèi)所有mRNA均逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后將所有cDNA--片段克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中,構(gòu)建成含有不同cDNA--片段的克隆載體混合物,這就是cDNA文庫。目前許多組織或細(xì)胞的基因組或cDNA文庫都可以從商業(yè)公司買到。

2.當(dāng)獲得了基因組文庫或cDNA文庫,可以根據(jù)已知的信息合成特異性探針,采用核酸分子雜交的方法從文庫中篩選感興趣的基因片段,這仍是目前獲得新基因的一種常用手段?;蚪M文庫或cDNA文庫的構(gòu)建和使用請參見本書相應(yīng)的章節(jié)。

 

實(shí)驗代做服務(wù):

 

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免疫細(xì)胞化學(xué)ICC實(shí)驗服務(wù)

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PKC活性檢測實(shí)驗

非標(biāo)定量實(shí)驗

(Label-free)

 

DIGE技術(shù)實(shí)驗服務(wù)

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NF-KB p65活性檢測實(shí)驗

 

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主營:實(shí)驗室代做實(shí)驗項目$r$n1.實(shí)驗代做$r$n2.生化試劑、標(biāo)準(zhǔn)

免疫組化技術(shù)服務(wù)

公司主營:免疫組化技術(shù)服務(wù)$r$n1實(shí)驗代做$r$n2生化試劑、標(biāo)準(zhǔn)品

實(shí)時熒光定量PCR(RealTime PCR)技術(shù)服務(wù)

主營:實(shí)時熒光定量PCR(RealTime PCR)技術(shù)服務(wù)$r$n1

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