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聚乙二醇沉淀試驗(yàn)檢測(cè)步驟分析
閱讀：2514 發(fā)布時(shí)間：2013-6-3 聚乙二醇沉淀試驗(yàn)檢測(cè)步驟分析CIC
聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是一種無(wú)電荷的直鏈大分子多糖，可非特異性地引起蛋白質(zhì)沉淀。沉淀具有可逆性，被沉淀的蛋白質(zhì)生物活性亦不受影響。不同濃度的PEG可沉淀分子量不同的蛋白質(zhì)，在pH值、離子濃度等條件固定時(shí)，蛋白質(zhì)分子量越大，用以沉淀的PEG濃度越小。由于PEG 6000對(duì)蛋白質(zhì)沉淀具有良好的選擇性，所以在IC測(cè)定中主要采用PEG 6000。
PEG使IC沉淀的機(jī)理可能在于使其自液相中空間排斥而析出，此外，PEG還可抑制CIC解離，促進(jìn)CIC進(jìn)一步聚合成更大的凝聚物而被沉淀。在被檢血清中加入低濃度PEG，可將血清中的IC沉淀下來(lái)，利用透光率比濁或散射比濁法可測(cè)出CIC的存在與含量。本法簡(jiǎn)便易行，國(guó)內(nèi)已廣泛應(yīng)用。
（一）試劑
1．0．1mol／L pH8．4硼酸鹽緩沖液（borate buffer solution，BBS） 硼酸（H3B03）3.40g，硼砂（Na2B407·10H20）4．29g，蒸餾水溶解后，加至1 000mL。用G3或G4玻璃濾器過(guò)濾。
2．PEG-NaF稀釋液 PEG 6 000 40．9g，NaF 10．0g，用BBS溶解后加至1 000mL，用G3或G4玻璃濾器過(guò)濾。
3．熱聚合人IgG 將人IgC（10mg/mL）置63℃水浴加熱15rain，立即置冰浴內(nèi)，冷卻后過(guò)Sepharose4B柱或SephacrylS-300柱，收集*蛋白峰。所獲熱聚合人IgG可用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量。也可取人IgG（10mg/mL）10mL，攪拌下滴加1．8％戊二醛100uL，24h后加入0．4mol/LpH5．4，Tris-HCl緩沖液100uL終止反應(yīng)，過(guò)Sepharose 4B或Sephacryl S-300柱，用0．01mol／LpH7．4磷酸鹽緩沖液洗脫，收集*蛋白峰。加入牛血清白蛋白至0．5％，分裝后—40℃保存。試驗(yàn)中可用作陽(yáng)性對(duì)照和制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。
（二）操作步驟
1．取待測(cè)血清0．15mL，加BBS0．3mL（1：3稀釋）。
2．按表10—1加入各液（待測(cè)血清zui終稀釋倍數(shù)為1：33，PEGzui終濃度為3．64％）。
3．將測(cè)試管及對(duì)照管置37℃水浴60rrfin。
4．分光光度計(jì)在波長(zhǎng)495nm測(cè)吸光度，用對(duì)照管調(diào)零。
（三）結(jié)果判斷
待測(cè)血清濁度值：（測(cè)定管吸光度—對(duì)照管吸光度）X100。以大于正常人濁度值的均值加2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差為CIC陽(yáng)性。
參考值：4．3±2．0，以大于或等于8．3為CIC陽(yáng)性。或以不同濃度熱聚合人IgG按以上方法操作制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測(cè)血清吸光度值查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得IC含量（相當(dāng)于熱聚合人IgG的ug/mL）。
（四）注意事項(xiàng)
1．低密度脂蛋白可引起濁度增加，故應(yīng)空腹采血。
2．高丙球血癥或血脂含量過(guò)高及標(biāo)本反復(fù)凍融，均可導(dǎo)致IC檢測(cè)出現(xiàn)假陽(yáng)性。
3．此法快速、簡(jiǎn)便，但特異性較差，較適用于血清標(biāo)本的篩查。
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