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ELISA實驗之細(xì)胞樣本的處理方法
閱讀：2133 發(fā)布時間：2021-3-17
細(xì)胞樣本根據(jù)目的物所在部位可選擇細(xì)胞裂解液或細(xì)胞培養(yǎng)上清作為樣本。 需要注意的是： 因該類樣本干擾因素較多， 如細(xì)胞狀態(tài)、 細(xì)胞數(shù)量(大于 10^6)、ph(約為 7)、培養(yǎng)基鹽離子濃度、采樣時間等，所以可能存在檢測不出的情況。
如果目的物是分泌型，主要在胞外，即可選擇細(xì)胞培養(yǎng)上清作為樣本，如果目的物主要存在于胞內(nèi)，則建議選擇細(xì)胞裂解液作為樣本類型。細(xì)胞培養(yǎng)上清處理方法相對簡單，取細(xì)胞培養(yǎng)上清，1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測。
細(xì)胞裂解液：
1）貼壁細(xì)胞需要先用胰酶消化，離心收集細(xì)胞（懸浮細(xì)胞可直接離心收集） ；
2）將收集到的細(xì)胞用冷PBS 洗3次；
3）物理方法裂解細(xì)胞（可先超聲破碎細(xì)胞，再反復(fù)凍融） ：
⇒ 超聲破碎：取適量PBS 重懸細(xì)胞，用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂；
⇒ 反復(fù)凍融：將待破碎的細(xì)胞在-20 度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)3次，使細(xì)胞溶脹破碎；
4）將標(biāo)本于2-8 度 1500×g 離心 10 分鐘，收集上清備用。
一般情況下，物理方法如反復(fù)凍融，勻漿等方法會比化學(xué)方法好，因為化學(xué)方法會引入酸或堿，可能會對ELISA實驗產(chǎn)生影響。我們也做了相關(guān)實驗來評測化學(xué)提取液和洗滌劑對ELISA檢測的影響，如 RIPA、TritonX-100、NP-40和SDS、脫氧膽酸鈉、β巰基乙醇、DTT 和尿素。根據(jù)我們的質(zhì)檢結(jié)果，高濃度的洗滌劑會影響ELISA檢測的終結(jié)果。然而，其效果會洗滌劑濃度的降低而減少。與其他化學(xué)裂解緩沖液相比，1％的 Triton X-100 和 1％NP-40 對 ELISA檢測的影響較小。如果一定要用化學(xué)提取方法的話，推薦用這兩種洗滌劑來提取靶蛋白。利用化學(xué)的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，如果去污劑成分會干擾抗原抗體反應(yīng)影響檢測效果，推薦利用透析和超濾的方法除去去污劑成分。
處理樣本的過程就是收集目標(biāo)蛋白的過程，由于蛋白容易變性，降解，故該過程應(yīng)盡量溫和。樣本處理之后的儲存也非常重要，尤其注意不要反復(fù)凍融，樣本處理之后可分裝密封保存， 4 度保存應(yīng)小于 1 周，-20 度不應(yīng)超過 1 個月，-80度不應(yīng)超過2個月。在標(biāo)本使用前應(yīng)緩慢均衡至室溫，不應(yīng)加熱使之融解。樣本的處理是實驗成功的第yi步, ，以上就是關(guān)于常見樣本處理方法的一個簡述，供研究者參考。