ELISA檢測肺炎支原體抗體IgM

    [檢測方法]  ELISA

    [方法學(xué)原理]  將微孔表面包被純化的肺炎支原體抗原，將被稀釋過的患者血清加入微孔中，如存在支原體抗體可與微孔上抗原相結(jié)合，然后洗去未結(jié)合物質(zhì)，再加入酶標(biāo)記抗人IgM與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，洗去未結(jié)合的酶標(biāo)記抗體，zui后加入顯色液。在特定時間終止顯色反應(yīng)，通過酶標(biāo)儀校正和對照相比讀出結(jié)果。

    [標(biāo)本準(zhǔn)備]  取新鮮末梢血或靜脈血。如采血后24h內(nèi)不能進(jìn)行試驗，分離血清后將其保存于一20℃環(huán)境中。檢測時，使樣本恢復(fù)至室溫。

    [試劑]

    1．預(yù)包被微孔板

    2．陽性對照

    3．弱陽性對照

    4．陰性對照

    5．標(biāo)本稀釋液

    6．濃縮酶聯(lián)物

    7．底物A、B

    8．終止液

    [儀器]  酶標(biāo)儀或全自動酶聯(lián)免疫檢測儀。

    [檢測步驟]

    1．配制洗滌液  1瓶濃縮洗滌液加475ml蒸餾水。配好的洗滌液短期內(nèi)可置室溫環(huán)境，長期可存于2—8℃環(huán)境中。

    2．配制酶聯(lián)物  按1：101倍稀釋，即取10tzl濃縮酶聯(lián)物加酶聯(lián)物稀釋液l 000ul（根據(jù)檢測標(biāo)本數(shù)量確定稀釋量），未用完的丟棄。

    3．待試劑盒平衡至室溫后，待測標(biāo)本用按1：51稀釋，取4ul血清與200u1標(biāo)本稀釋液混合。

    4．將稀釋標(biāo)本置37℃環(huán)境中20min。

    5．各加100ul陽性、弱陽性、陰性對照及已稀釋待測標(biāo)本上清液于相應(yīng)孔中，空白對照孔加100ul標(biāo)本稀釋液，蓋好反應(yīng)板，37℃環(huán)境中孵育30min。

    6．甩盡板中液體，每孔用200—300ul洗滌液洗5次，每次均需拍干。

    7．每孔加酶聯(lián)物100t~l，蓋好反應(yīng)板，37℃環(huán)境中30min。

    8．甩盡板中液體，洗5次，每次拍干。

    9．加底物A、B各1滴或各50P1，混勻，37℃環(huán)境中15min。

    10．取出，加終止液1滴，用酶標(biāo)儀450nm測其OD值。若肉眼觀察，不加終止液判斷結(jié)果。

    [結(jié)果判斷]

    1．陰性對照平均OD值須小于0．20。

    2．弱陽性對照平均OD值須在0．20～0．65。

    3．弱陽性對照和陰性對照的平均OD值之比須≥2。符合以上3種條件時，本試驗結(jié)果可信，否則重復(fù)試驗。

    4．若待測標(biāo)本孔顯色比弱陽性對照孔深則判為陽性，反之為陰性。但在弱陽性對照值上下10％范圍內(nèi)再測1次，如確實高于弱陽性對照則可判為陽性。

    [注意事項]

    1．本試驗結(jié)果須結(jié)合臨床表現(xiàn)、病史作出診斷，方可采取適當(dāng)臨床處理。

    2．試劑盒內(nèi)雖然含有消除干擾因子的物質(zhì)，但仍可能會有少量標(biāo)本難以除盡干擾。因此，如果某標(biāo)本幾項IgM均為陽性，應(yīng)考慮有RF的干擾。

    [臨床意義]  IgM抗體是早期抗體，于起病第1周末出現(xiàn)，用于早期診斷；IgG抗體是恢復(fù)期抗體，于起病2—3周后出現(xiàn)，動態(tài)觀察可用于確定診斷。

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