酶聯(lián)免疫吸附測定ELISA之顯色與比色

    在目前的以HRP作為標(biāo)記酶的商品ELISA試劑盒中，如以TMB為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應(yīng)用液；如以OPD為底物，則試劑盒提供OPD片劑或粉劑，臨用前配制。一般商品試劑盒顯色反應(yīng)條件為37℃或室溫反應(yīng)15～30min。從理論上說，37℃30min才可以使HRP的底物催化反應(yīng)*，盡管在zui初的10min內(nèi)，絕大部分催化反應(yīng)即可完成。因此，為使弱陽性樣本孔能有充分的顯色，建議在37℃下反應(yīng)25～30min后，終止反應(yīng)比色測定。

    此外，在加入底物開始顯色反應(yīng)前，是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將A和B兩種液各加1滴于清潔的空板孔或eppendorf管中，觀察是否有顯色出現(xiàn)，如有，則說明底物已變質(zhì)。以OPD為底物，配好后應(yīng)為五色，否則就不能使用。以TMB為底物，整個顯色反應(yīng)過程無需避光，而以OPD為底物，則需避光進(jìn)行。關(guān)于TMB和OPD的顯色反應(yīng)特點(diǎn)及注意點(diǎn)可參考前面有關(guān)章節(jié)內(nèi)容。顯色反應(yīng)完成后，加入酸終止反應(yīng)，振蕩混勻后即可進(jìn)行下面的比色測定或肉眼判斷結(jié)果。

    ELISA的比色測定由酶標(biāo)儀進(jìn)行。有的同行可能會認(rèn)為，既然由酶標(biāo)儀進(jìn)行，那么此時便可以萬事大吉了，其實(shí)不然，因?yàn)楫?dāng)代較為*的酶標(biāo)儀，均有較多的功能，使用不當(dāng)，會得到令人難以理解的結(jié)果。如使用酶標(biāo)儀比色測定后，有許多的陰性測定孑L的吸光度值為負(fù)數(shù)；或測定假陽性率大大增加等等。這主要是沒有正確地理解和使用酶標(biāo)儀所致。

    1．比色測定時，一定要注意酶標(biāo)儀的波長是否已調(diào)至合適或所用濾光片是否正確。由于有的臨床實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行ELISA測定時，以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長為450nm，后者為492nm，濾光片需根據(jù)要求隨時更換。因此，容易出現(xiàn)濾光片錯用的問題。

    2．單波長或雙波長比色選擇的問題。中檔以上的酶標(biāo)儀基本上都同時具有單波長和雙波長比色功能。所謂的單波長比色即是通常的以對顯色具有zui大吸收的波長如450nm或492nm進(jìn)行比色測定；而雙波長比色則是酶標(biāo)儀在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測定1次，敏感波長下的吸光度測定值為樣本測定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長下測定即改變波長至一定值，使得樣本測定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度值為零，此時測得的吸光度即為臟物的吸光度值。

    zui后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長下的吸光度值與非敏感波長下的吸光度值的差。因此，雙波長比色測定具有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響的優(yōu)點(diǎn)，一般不必設(shè)空白孔。如在使用雙波長比色時，仍設(shè)空白孔，就可能會造成前面提到的測定孔吸光度為負(fù)數(shù)的現(xiàn)象。由于ELISA測定中單個空白孔的非特異吸收具有一定程度的不確定性，也就是說每次測定或同次測定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測定值，故而在ELISA測定比色時，是使用雙波長比色。

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