免疫熒光（IF）細(xì)胞化學(xué)染色方法--新手適用

免疫熒光（IF）細(xì)胞化學(xué)染色方法

一、標(biāo)本制作

　　可制作涂片、印片、細(xì)胞單層培養(yǎng)物、組織切片，經(jīng)適當(dāng)固定或不固定，作免疫熒光染色用。

二、熒光抗體染色方法

　　（一）直接法

　　1．染色 切片經(jīng)固定后，滴加經(jīng)稀釋至染色效價(jià)如1：8或1：16的熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體或兔抗人IgG或IgA熒光抗體等），在室溫或37℃染色30min，切片置入能保持潮濕的染色盒內(nèi)，防止干燥。

　　2．洗片 　傾去存留的熒光抗體，將切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗兩次，攪拌，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結(jié)晶。

　　3．用50%緩沖（0.5mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0～9.5）甘油封固、鏡檢

　　4．對(duì)照染色

　　①正常免熒光血清染色，如上法處理切片，結(jié)果應(yīng)為陰性。②染色抑制試驗(yàn)（一步法）：將熒光抗體和未標(biāo)記的抗體球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法處理切片。結(jié)果應(yīng)為陰性。為證明此種染色抑制不是由于熒光抗體被稀釋所致，可用鹽水代替未標(biāo)記抗血清，染色結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性。此法結(jié)果較二步法穩(wěn)定。③類(lèi)屬抗原染色試驗(yàn)，前面已作敘述。

　　直接法比較簡(jiǎn)單，適合做細(xì)菌、螺旋體、原蟲(chóng)、真菌及濃度較高的蛋白質(zhì)抗原如腎、皮膚的檢查和研究。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應(yīng)的抗原，特異性高而敏感性較低。

　　（二）間接法

　　（1）切片固定后用毛細(xì)滴管吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度，37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗兩次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液體。

　?。?span lang="EN-US">2）再滴加間接熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體等），同上步驟，染色30min，37℃，緩沖鹽水洗兩次10min，攪拌，緩沖甘油封固，鏡檢。

　　對(duì)照染色：①抗體對(duì)照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法進(jìn)行染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。②抗原對(duì)照：即類(lèi)屬抗原染色，亦應(yīng)為陰性。③陽(yáng)性對(duì)照。

　　間接法中上述方法稱(chēng)雙層法（Double Layer Method）。另一種稱(chēng)夾心法，即用未標(biāo)記的特異性抗原加在切片上先與組織中之相應(yīng)抗體結(jié)合，再用該抗原之熒光抗體重疊結(jié)合其上，而間接地顯示出組織和細(xì)胞中抗體的存在，方法步驟如下：

　　①切片或涂片固定后，置于染色濕盒內(nèi)。

　　②滴加未標(biāo)記的特異性抗原作用切片于37℃，30min。

　　③緩沖鹽水洗2次，每次5min，吹干。

　　④滴加特異性熒光抗體再用切片于37℃，30min。

　　⑤如③水洗。

　　⑥緩沖甘油封固，鏡檢。

　　間接法只需制備一種熒光抗體可以檢出多種抗原，敏感性較高，操作方法較易掌握，而且能解決一些不易制備動(dòng)物免疫血清的病原體（如麻疹）等的研究和檢查，所以已被廣泛應(yīng)用于自身抗體和感染病人血清的試驗(yàn)。

　　（三）補(bǔ)體法

　　1．材料

　?。?span lang="EN-US">1）免疫血清60℃滅活20min，用Kolmers 鹽水作2倍稀釋成1：2，1：4，1：8……。補(bǔ)體用1：10稀釋的新鮮豚鼠血清，抗補(bǔ)體熒光抗體等，按下述的補(bǔ)體法染色。免疫血清補(bǔ)體結(jié)合的效價(jià)，如為1：32則免疫血清應(yīng)作1：8稀釋。

　　（2）補(bǔ)體用新鮮豚鼠血清一般作1：10稀釋或按補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)試管法所測(cè)定的結(jié)果，按2單位的比例，用Kolmers鹽水稀釋備用。Kolmers鹽水配法：即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸緩沖鹽水中，溶解MgSO4的含量為0.01%濃度。

　　（3）抗補(bǔ)體熒光抗體：在免疫血清效價(jià)為1：4，補(bǔ)體為2單位的條件下，用補(bǔ)體染色法測(cè)定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價(jià)，然后按染色效價(jià)1：4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。

　　2．方法步驟

　?。?span lang="EN-US">1）涂片或切片固定。

　　（2）吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋之免疫血清及補(bǔ)體之等量混合液（此時(shí)免疫血清及補(bǔ)體又都稀釋一倍）滴于切片上，37℃作用30min，置于保持一定濕度的染色盒內(nèi)。

　　（3）用緩沖鹽水洗2次，攪拌，每次5min，吸干標(biāo)本周?chē)骸?span lang="EN-US">

　　（4）滴加經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋之抗補(bǔ)體熒光抗體30min，37℃，水洗同（3）。

　?。?span lang="EN-US">5）蒸餾水洗1min，緩沖甘油封固。

　　3．對(duì)照染色

　?。?span lang="EN-US">1）抗原對(duì)照。

　?。?span lang="EN-US">2）抗血清對(duì)照：用正常兔血清代替免疫血清。

　?。?span lang="EN-US">3）滅活補(bǔ)體對(duì)照：將補(bǔ)體經(jīng)56℃30min處理后，按補(bǔ)體同樣比例稀釋?zhuān)c免疫血清等量混合后，進(jìn)行補(bǔ)體法染色。

　　本法之熒光抗體不受免疫血清的動(dòng)物種屬的限制，因而一種熒光抗體可作更廣泛的應(yīng)用，敏感性亦較

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