IHC（P） 免疫組化石蠟切片操作規(guī)程 ――（新手適用）

免疫組化操作規(guī)程――石蠟切片

（一）、儀器設(shè)備

    1）18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫(yī)用微波爐；

    2）水浴鍋

（二）、試劑

    1）PBS緩沖液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。

    2）0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（CB，pH6.0，1000ml）：檸檬酸三鈉 3g，檸檬酸 0.4g。

    3）0.5mol/L EDTA緩沖液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH調(diào)至pH8.0,加水至1000ml。

    4）1mol/L的TBS緩沖液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調(diào)至pH8.0,加水至1000ml。

    5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2（pH7.8） 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

    6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

    7）封裱劑：

    a、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.0～9.5）等量混合；

    b、油和TBS（或PBS）配制。 

    8）TBS/PBS pH9.0～9.5，適用于熒光顯微鏡標(biāo)本；pH7.0～7.4適合于光學(xué)顯微鏡標(biāo)本。

（三）、操作流程

    1、脫蠟和水化

    脫蠟前，應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。

    1）組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10分鐘；

    2）無水乙醇中浸泡5分鐘；

    3）95%乙醇中浸泡5分鐘；

    4）70%乙醇中浸泡5分鐘；

    2、抗原修復(fù)

   用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。

   1）抗原熱修復(fù)

   （1）高壓熱修復(fù) 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進(jìn)行鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會(huì)升起來。10分鐘后，去除熱源，置入涼水中，當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測(cè)或核抗原的抗原修復(fù)。

   （2）煮沸熱修復(fù) 電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10~15分鐘。

   （3）微波熱修復(fù) 在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5~10分鐘，反復(fù)1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。

   2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱至37℃，切片也預(yù)熱至37℃，消化時(shí)間約為5~30分鐘；胃蛋白酶消化37℃時(shí)間為30分鐘。適用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。

抗原修復(fù)注意事項(xiàng)：

1）載玻片的處理：

    抗原修復(fù)過程中，由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證試驗(yàn)的正常進(jìn)行，可選用PES、Poly-L-Lysine等試劑，對(duì)已清洗的載玻片進(jìn)行處理。具體方法如下：

1.1 APES：現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中，停留20~30秒鐘，取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結(jié)合的APES，置通風(fēng)櫥中晾干即可。用此載玻片撈片時(shí)應(yīng)注意組織要一步到位，并盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結(jié)果。

1.2 Poly-L-Lysine：將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5分鐘，60oC烤箱烘烤一小時(shí)或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗(yàn)中使用的器具均為非玻璃制品。

2）常用酶消化：

2.1 胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%~0.1%，消化時(shí)間為37℃、10~40分鐘，主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示。

2.2 胃蛋白酶：一般使用濃度為0.4%，消化時(shí)間為37℃、30~180分鐘，主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示，如：Laminin（層粘蛋白），Collagen IV（IV型膠原）等。

2.3 皂素（Saponin）：一般使用濃度為2~10?g/ml的saponin溶液，消化時(shí)間為室溫孵育30分鐘。

3）抗原熱修復(fù)：

可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體條件，選用微波爐抗原修復(fù)、高壓鍋抗原修復(fù)或水浴高溫抗原修復(fù)?？乖瓱嵝迯?fù)可選用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實(shí)驗(yàn)證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）效果。請(qǐng)選用我公司提供的ZLI-9064 枸櫞酸鹽緩沖液（粉劑）配制，取該粉劑一包溶于1000ml的蒸餾水中，混勻，其pH值在6.0 ± 0.1，如因蒸餾水本身造成的pH值偏差，請(qǐng)自行調(diào)整。

3.1 石蠟切片微波爐抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水后，3％H2O2處理10分鐘，蒸餾水洗2分鐘×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92℃~98℃之間并持續(xù)10~15分鐘（注意：無論是使用醫(yī)用或家用微波爐，請(qǐng)根據(jù)具體機(jī)型酌情設(shè)置條件，務(wù)必滿足以上步驟中對(duì)溫度和時(shí)間的要求）。取出容器，室溫冷卻10~20分鐘（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復(fù)原有的空間構(gòu)型）。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。

3.2 石蠟切片高壓抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內(nèi)，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當(dāng)壓力鍋開始慢慢噴氣時(shí)（約加熱5~6分鐘后），計(jì)時(shí)1~2分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘×3，下接免疫組化染色步驟。

3.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水后，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，并將此容器置于盛有一定數(shù)量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達(dá)92℃~98℃起開始計(jì)時(shí)15~20分鐘，然后端離電爐，室溫冷卻20~30分鐘，蒸餾水沖洗，PBS洗，下接免疫組化染色步驟。

    3、免疫組織化學(xué)染色

    SP法

    1）脫蠟、水化；

    2）PBS洗2～3次各5分鐘；

    3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘；

    4）PBS洗2～3次各5分鐘；

    5）抗原修復(fù)；

    6）PBS洗2～3次各5分鐘；

    7）滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。

    8）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時(shí)或者4℃過夜或者37℃1小時(shí)。

    9）4℃過夜后需在37℃復(fù)溫45分鐘。

    10）PBS洗3次各5分鐘；

    11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置，或37℃1小時(shí)；

    12）II抗中可加入0.05%的tween-20。

    13）PBS洗3次各5分鐘；

    14）DAB顯色5～10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；

    15）PBS或自來水沖洗10分鐘；

    16）蘇木精復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化；

    17）自來水沖洗10～15分鐘；

    18）脫水、透明、封片、鏡檢。

    SABC法

    1）脫蠟、水化。

    2）PBS洗兩次各5分鐘。

    3）用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10分鐘，蒸餾水洗3次。

    4）抗原修復(fù)。

    5）PBS洗5分鐘。

    6）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。

    7）滴加Ⅰ抗,室溫1小時(shí)或者4℃過夜或者37℃1小時(shí)（4℃過夜后在37℃復(fù)溫45分鐘）。

    8）PBS洗三次每次2分鐘。

    9）滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分鐘。

    10）PBC洗3次每次2分鐘。

    11）滴加試劑SABC，20℃～37℃20分鐘。

    12）PBS洗4次每次5分鐘。

    13）DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。

    14）蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染2分鐘、鹽酸酒精分化。

    15）脫水、透明、封片、鏡檢。

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