ELISPOT 技術簡介

　　隨著酶聯(lián)免疫分析技術在醫(yī)學及生物學領域的廣泛應用 , 使體外檢測各種細胞因子及抗體研究有了新的突破。在研究免疫應答機制時以往常用用酶聯(lián)免疫吸附法（ ELISA ）檢測體液中游離的細胞因子（ CK ）或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體或 CK 的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結合，而不能確切的反映體內(nèi)的抗體及 CK 的水平。 80 年代，國外的科研工作者根據(jù) ELISA 技術的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細胞和 CK 分泌細胞的固相酶聯(lián)免疫斑點技術（ ELISPOT ）。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國內(nèi)外廣泛應用，對探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機制具有重要意義。

　　ELISPOT 法源自 ELISA ，又突破傳統(tǒng) ELISA 法，是定量 ELISA 技術的延伸和新的發(fā)展。兩者都是檢測細胞產(chǎn)生的細胞因子或其他可溶性蛋白，它們zui大的不同在于：

n         ELISA 通過顯色反應，在酶標儀上測定吸光度，與標準曲線比較得出可溶性蛋白總量。

n         ELISPOT 也是通過顯色反應，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數(shù)斑點或通過 CTL 公司的 ELISPOT 分析系統(tǒng)對斑點進行計數(shù)， 1 個斑點代表 1 個細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率。（某些研究不僅要測細胞因子生成量，還需檢測分泌此細胞因子的細胞頻率）

n         由于是單細胞水平檢測， ELISPOT 比 ELISA 和有限稀釋法等更靈敏，能從 20 萬 -30 萬細胞中檢出 1 個分泌該蛋白的細胞。

n         捕獲抗體為高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細胞時，不會影響活化細胞分泌細胞因子。

　　ELISPOT全名為Enzyme-linked Immunospot Assay，其技術原理與ELISA相似。其實驗設計是在96微孔培養(yǎng)盤底部披覆PVDF薄膜，用來吸附特殊挑選、且無毒性（不含sodium azide、內(nèi)毒素endotoxin）的單株抗體。靜脈血PBMC細胞經(jīng)適當分離處理后，會被分配到微孔盤上，再接受適當?shù)目乖碳?，并將微孔盤放置于溫箱中過夜培養(yǎng)一段時間。一般而言，記憶型T細胞在受抗原刺激數(shù)小時后會開始分泌細胞激素，此時局部（在緊靠分泌細胞的周圍）分泌出的細胞激素會被PVDF薄膜上特異抗體捕獲。微孔盤中的細胞被移除并清洗后，被捕獲的細胞激素可進一步使用生物素（Biotin）標記的二次抗體來標志，其后再以結合酵素的StreptAvidin與之作用，并加入酵素受質(zhì)使其呈色，有反應作用的細胞會留下染色斑點。

ELISPOT 檢測原理 

　　細胞受到刺激后局部產(chǎn)生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后， 被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結合，其后再與堿性磷酸酶標記的親和素結合。 BCIP/NBT 底物孵育后， PVDF 孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細胞產(chǎn)生了細胞因子，通過 CTL 公司生產(chǎn)的 ELISPOT 酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點的分析后得出結果。

ELISPOT 分析儀的出現(xiàn)解決了以下問題 

n         哪些斑點是抗原特異性 T 細胞產(chǎn)生的（此斑點具有進一步分析價值），哪些是無關細胞產(chǎn)生的（此斑點沒有 T 細胞研究價值）

n         斑點大小的意義

n         在對不同細胞因子計數(shù)和分析時，如何定義斑點zui大和zui小尺寸

n         如何從單個細胞基礎上分析

n         實驗度有多高？如果一個細胞產(chǎn)生相似的細胞因子，在多大程度上會干擾分析結果？

n         幾次重復實驗才能使結果更有意義？

ELISPOT 斑點的判讀

　　像多數(shù)的Cell-based分析技術一樣，ELISPOT Cytokine技術也是相當耗時、耗勞力的工作。事實上到目前為止，以目視法判讀少量細胞族群的特性如激活T細胞之激素分泌，仍被視為是免疫學技術上的一大挑戰(zhàn)。ELISPOT結果的判讀常需要專聘、有經(jīng)驗的技術員才可以；有時就算有專職技師判讀，使用傳統(tǒng)的顯微鏡計算斑點數(shù)仍不免會偶有主觀意見，而有所偏頗。

　　科學實證的本質(zhì)，在于如何使實驗結果能盡可能客觀、、同時有高重現(xiàn)性，傳統(tǒng)的人工計算法顯然無法達到此一要求。故而有幾個科研團隊使自行開發(fā)Plate Scanner與自動分析軟件，其中以Paul Lehmann教授研究開發(fā)之ImmunoSpot? Analyzer自動分析儀代表性。分析ELISPOT實驗數(shù)據(jù)的過程中，儀器先以高分辨率鏡頭捕捉微小孔中膜上呈色影像，而后儲存成TIF檔；這些影像可以進一步使用手動、或是自動方式計算斑點數(shù)目，如果使用ImmuneSpot分析軟件，可以先設定條件，然后同時分析斑點的大小，以推估激素分泌的多寡。預料像ImmunoSpot? Analyzer這一類自動圖像掃描分析儀器，將可克服傳統(tǒng)顯微鏡判讀方法耗費人力、及人為客觀性等缺點，*解除ELISPOT分析技術的瓶頸問題，進一步推廣該技術的新穎應用。

　　ImmunoSpot@影像掃描分析儀可以提供不同的數(shù)據(jù)格式，包括未處理與處理過的膜表面影像、每個小孔中的斑點數(shù)目、每個小孔中的平均斑點數(shù)目、每個小孔中斑點大小的直方統(tǒng)計圖。

ELISPOT技術的過去

　　ELISPOT是20多年前便己研發(fā)成功的老技術。Czerkinsky 等人在1983年，運用該技術成功地檢測出因受激而分泌抗體的B細胞頻率。從那時起世界各國免疫學者便開始一長期的ELISPOT Cytokine技術競賽，每個團隊都希望能將此一技術推廣來研究T細胞免疫，其絕妙之處在提供一接近體內(nèi)實驗的環(huán)境，藉由偵測T細胞分泌的各類細胞因子，來定量機體內(nèi)免疫反應啟始者Precursor T的clonal size族群大小，同時預測體內(nèi)免疫系統(tǒng)即將進行的下游免疫反應。

　　ELISPOT Cytokine技術雖說操作簡單，但該技術并沒能如預期地很快地被成功應用在ex vivo T細胞功能研究。要讓ELISPOT技術從B細胞免疫走向T細胞免疫的產(chǎn)生的*個主要問題，便是靈敏度的提升，因為T細胞因子較之B細胞免疫球蛋白產(chǎn)量極少。早期ELISPOT的分析條件不是非常理想，成對抗體的品質(zhì)、呈色底膜的材質(zhì)等幾個技術性的問題，使當時多數(shù)研究團隊很難獲得清晰的斑點，結果是敏感度不夠、數(shù)據(jù)分析重現(xiàn)性低。這問題直到1996美國俄亥俄卅Case Western Reserve大學Paul Lehmann團隊引進PVDF薄膜的應用（Forsthuber et al., Science, 1996），才釜底抽薪地解決了該技術因斑點呈色問題造成低敏感度的缺失。與原來的標準膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的較大面積來吸附單株抗體，使T細胞分泌的各類細胞因子能在細胞周圍就近被俘虜，讓呈色斑點集中、清晰、對比色高，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。圖一是使用PVDF-BASED改良薄膜（Panel A）與傳統(tǒng)標準薄膜（Panel B）并行實驗的比較結果。同樣的人體 PBMC樣品，在通過*相同的實驗，Panel A呈現(xiàn)較清晰的小色點。

　　第二個技術性問題是ELISPOT Cytokine實驗分析的幾個基本假設缺乏科學實證，也使得該技術在當時并沒受到該有的廣泛重視。沒有科研人員嘗試去厘清一些基礎但很重要的問題，諸如； 　　

n         實驗所得的斑點是抗原特定T細胞所生產(chǎn)，還是旁觀細胞受Cytokine刺激的次級效應？

n         斑點的小或大有何生理意義；如何決定cutoff值？

n         能否相信斑點是由單一的細胞造成？

n         ELISPOT Cytokine分析技術能準確測量的頻率范圍？

n         如果效應相互拮抗的cytokine同時產(chǎn)生，它們是否會互相妨礙？及到什么程度？

ELISPOT 技術的現(xiàn)在

　　1996年以來隨著抗體制備、PVDF膜材篁等技術改良，ELISPOT 分析技術已經(jīng)逐漸達到科研人員的期待，它已是當世*zui靈敏抗原特定T細胞的體外檢測技術。藉由檢驗新鮮分離PBMC細胞所分泌cytokine的指紋，ELISPOT 分析技術可提示T細胞免疫系統(tǒng)的兩個重要參數(shù)：抗原特定T細胞的clone族群大??；和免疫效應細胞的信號傳導路徑Th1/Th2。

　　多年來經(jīng)過數(shù)十個研究團隊的致力研究，對于ELISPOT分析技術本身的幾個問題，也有了科學上的驗證。目前一般*，ELISPOT技術允許科研人員在單細胞水平上識別抗原特定T細胞，主要針對經(jīng)由CD4或者CD8細胞的免疫反應。在適當?shù)膶嶒炘O計下，ELISPOT Cytokine 斑點的數(shù)量分析顯示斑點是由一個單細胞所生成，同時斑點形態(tài)學與Time Response分析則顯示斑點直徑大小直接反映該細胞族群的產(chǎn)能。也因為如此，ELISPOT是個免疫學上的標竿技術，它可以允許科研人員在幾乎自然生理條件下，觀察細胞實際分泌Cytokine的進程，進而可以得到藥理學信息，闡明免疫調(diào)節(jié)藥物如何影響T細胞分泌各類cytokine的速率。藥物抑制T細胞免疫一般可通過兩程截然不同的機轉(zhuǎn)；使能分泌Cytokine的Precursor T細胞族群變小，或減少每Precursor T細胞的cytokine產(chǎn)能，而ELISPOT技術能提供雙份信息。

　　ELISPOT分析技術的幾個特點已經(jīng)讓它在抗原特定T細胞免疫學上*。此技術是當世*準許百萬分之一1:1000,000的準確分析，如此強效的解析力使流式細胞技術也望其項背，以目前國內(nèi)外常規(guī)的intracellular cytokine或者Dimer/ tetramer染色，流式技術的靈敏度一般限制在1:10,000。這樣的高靈敏度對T細胞免疫學研究是必須的，因為抗原特定T細胞一般在機體周邊循環(huán)系統(tǒng)發(fā)生的頻率通常低于萬中取一。此外由于ELISPOT Cytokine技術被證實適用于冰凍后復蘇的人類淋巴球，解凍后PMBC與新鮮分離樣品有相當?shù)男r，沒有喪失功能。這一點對臨床試驗非常重要，它使科研人員得以并行分析免疫治療前、后的病人血樣，如果試驗牽涉全國多個臨床試驗機構，病人血樣可冰存并同時集中在「*實驗室」一齊被測試。同理，一個血樣或標準對照品可被分裝小份，被送到不同檢驗中心進行測試，以交互比對，同時有利LISPOT Cytokine技術流程的規(guī)范化、標準化。

ELISPOT 未來展望

　　據(jù)筆者的觀察，ELISPOT 分析技術正在歐美各國發(fā)揮它的完整潛能，它讓免疫學家可以直接洞察活體內(nèi)T細胞相關生理學或病理學，就像是心臟外科醫(yī)師手上的那張心電圖，經(jīng)由這個技術科研人員可以在活體內(nèi)直接進入一個器官系統(tǒng)，在那里視察、發(fā)掘，得到全新的智識。

　　從各國文獻可見ELISPOT技術已經(jīng)達到標準化、規(guī)范化的要求，并被廣泛地應用在多項領域，包括監(jiān)視癌癥病人接受免疫療程時的反應（Lewis, 2000 and Janetzki, 2000），以及感染性疾病（Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000）、腫瘤（Nagorsen, 2000）、或自體免疫病人體內(nèi)的一個特定的免疫反應型式（Pelfrey, 2000）。ELISPOT技術同時也在數(shù)個疫苗效價評估人體試驗中，被當成重要的終結指針。2003年1月，世界衛(wèi)生組織通過與大陸北京性艾中心合作，將應用ELISPOT技術來監(jiān)測HIV疫苗研究免疫應答反應技術，該計劃將是利用ELISPOT技術對亞洲國家從事HIV疫苗研究和臨床試驗的有關研究。我們期待未來此一技術能在我國免疫學界得到廣泛地應用。

其它ELISPOT應用范圍

n         移植研究 – allograft rejection

n         疫苗開發(fā) -亦可評估疫苗效力，或是疫苗注射路徑影響

n         Th0/Th1/Th2細胞轉(zhuǎn)換分析

n         自體免疫研究 – 免疫調(diào)節(jié)及免疫治療研究

n         癌癥研究 -腫瘤反應T細胞作用

n         過敏機制探討 – IL-4誘導免疫球蛋白亞型轉(zhuǎn)換，其它參與過敏機制之細胞激素研究

n         傳染疾病研究 – Lyme disease, Chlamydia infections, Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple sclerosis, …等

n         抗原決定位定圖

n         體液免疫力研究 – B細胞免疫球蛋白及特定亞型反應的進展研究

目前 CTL 公司使用 ImmunoSpot 的部分研究領域如下

n         單細胞解析度/體外抗原特異性 T 細胞頻率的準確測量

n         測量 1 類和 2 類免疫力

n         T 細胞的同源性細胞因子產(chǎn)物與旁細胞因子產(chǎn)物

n         功能性 T 細胞親和力的測量

n         細胞因子協(xié)同表達 / 雙色 ELISPOT

n         斑點尺寸分布

n         PBMC的體外測量的分析到分析的重可生產(chǎn)性

n         新鮮和低溫儲藏后的人類PBMC的比較

n         CD 8+ T 細胞和CD8+ T 細胞和 Granzyme B 的 ELISPOT 分析

n         除了人類 PBMC 、鼠淋巴結/脾臟細胞以外的細胞的 ELISPOT 分析

n         免疫與佐藥

n         腫瘤免疫

n         移植免疫

ELISPOT 技術優(yōu)勢 

ELISPOT 分析使單細胞分泌產(chǎn)物可視化。這些分析異常敏感，因為它是在直接在分泌細胞的周圍進行捕捉，而且是在表面被沖淡，或者被臨近的細胞上的受體捕獲，或降解之前。

zui低至1：100萬細胞精度的活體外頻率測量。這種分辨率已經(jīng)遠遠超過使用細胞內(nèi)細胞因子的四聚物染色和 ELISA 法測量的精度。這種高敏感度是非常關鍵的，因為抗原特異性 T 細胞在體外都是典型性的低頻率。

高產(chǎn)量 T 細胞分析成為可行。一個經(jīng)過訓練的相關實驗室小組可以測試成百的樣本中幾十種抗原的反應。

只需要少量細胞，就可以用于通其他細胞學分析方法進行比較。例如，45毫升的血液就足以用于測試600種不同抗原/肽類物質(zhì)的反應。

可以定義CD4和CD8細胞的免疫因子指標。這是因為只需要少數(shù)細胞，分析就可以在高產(chǎn)量模式下進行。ELISPOT 分析在篩選肽庫，繪制免疫因子方面是一個理想的工具。

用于確定抗原特異性 T 細胞的功能性親和力。這zui大可能受到肽類藥物刺激至50%的影響。

可以用于研究未經(jīng)藥物處理過的細胞的分泌過程。如果觀察到凈產(chǎn)量減少，可以確定這種區(qū)別是來自于分泌細胞的減少，還是每個細胞分泌產(chǎn)量的減少。

淋巴細胞在 ELISPOT 分析后依然存活。這使得分析之后進行增值，用于更進一步的分析、克隆或者低溫儲藏成為可能。

低溫儲藏后的人類淋巴細胞可以用于檢測，而不會丟失其功能。治療前和治療后的樣本可以并排進行測試，結果可以重復。

選擇 CTL 的原因

　　我們是 ELISPOT 技術的世界

　　我們了當代細胞因子 ELISPOT 協(xié)議

　　我們將圖像分析引入 ELISPOT

　　我們制造了*臺商業(yè) ELISPOT 分析儀

　　我們將細胞因子 ELISPOT 分析提升到了科學

　　我們是 NIH 免疫耐受網(wǎng) ELISPOT 分析的實驗室

　　我們是 BD 公司* ELISPOT 分析儀

　　我們專注于 ELISPOT 技術并極大拓展了其應用領域

　　我們是*能提供整體 ELISPOT 方案的技術提供商

　　    基礎研究

　　    臨床免疫監(jiān)控

　　    全套軟件和硬件解決方案

　　    全套符合 GLP 規(guī)范的 ELISPOT 實驗室建設服務

　　    全面技術咨詢服務

　　    全面的基礎和臨床技術合作服務

　　我們是*能提供全套 ELISPOT 質(zhì)量控制的服務商

　　過去 15 年中，我們專注于 ELISPOT 研究，取得了巨大的成功。今后我們將一如既往地與客戶一起，全力推動 ELISPOT 的技術發(fā)展和進步。我們不僅提供 ELISPOT 全套技術解決方案，更看重并全力協(xié)助客戶掌握 ELISPOT 實驗技術。

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