共聚焦顯微鏡中的圖像是來自一個焦平面的光通過針孔數(shù)碼相機聚焦拍攝，從而規(guī)避來自其支點上方或下方的光。固定在設(shè)備上的激光連續(xù)聚焦在樣品的選定區(qū)域，同時，被樣品吸附的熒光染料也會被數(shù)碼相機捕捉。共聚焦設(shè)備包含兩個旋轉(zhuǎn)鏡頭用來拍攝組圖。
然后通過所累積的不同焦平面的圖像序列，使用軟件編譯完整的3d圖像。此圖像可以在軸向（z軸）和橫向（x和y軸）平面進行微調(diào)。這些細胞和其他矩陣的再現(xiàn)是通過使用雙倒置的光錐照亮物體來實現(xiàn)的。
使用標準落射熒光顯微鏡所存在的問題是當遇到較厚的基質(zhì)或標本時所表現(xiàn)出的熒光程度較大。大于2微米的樣品發(fā)出的輻射會危及生成圖像的準確性，從而損失成像的細節(jié)。而共聚焦顯微鏡則可以通過縮小激發(fā)范圍并使用光學切片來消除背景噪聲。
細胞外基質(zhì)(ECM)或?qū)儆谒屑毎姆羌毎煞?，在細胞功能中是不可少的。ECM的彈性調(diào)節(jié)細胞的許多生物學功能，例如間充質(zhì)干細胞的分化、粘附和遷移。
細胞生物學中常常通過水凝膠來模擬ECM。共聚焦顯微鏡的應(yīng)用主要在于可與聚丙烯酰胺凝膠的壓痕法結(jié)合使用。共聚焦自動圖像成像可以有效測量ECM模擬中的壓痕和穿孔。比如，共聚焦激光顯微鏡可以測量出PAAM凝膠組合物的深度和剛度。這種方法可以替代AFM納米壓痕法和微針法。
由于共焦成像可以可靠地探測大多數(shù)樣品表面下方0-200µm之間的任何位置。然而，重要的是要注意，每個樣本都有自己的深度，在該深度處散射、光漂白和噪聲太高。據(jù)說有些標本應(yīng)該*避免使用共聚焦顯微鏡。
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