Flash and Freeze
神經(jīng)科學的一個基本問題是:突觸的結構和功能特性之間的關系是什么?在過去的幾十年里，電生理學已經(jīng)闡明了突觸的傳導機制，而電子顯微鏡(EM)使人們對突觸的形態(tài)有了更深入的了解。將突觸生理學和超微結構聯(lián)系起來的方法可以追溯到20世紀中期，目的在于獲得突觸傳遞的圖像，即從電鏡拍攝的靜態(tài)圖片中捕捉動態(tài)過程。其中一種被稱為“閃光與凍結”（flash and freeze）的技術，結合了高壓冷凍（high-pressure freezing，HPF），對識別出的突觸前神經(jīng)元的光發(fā)生刺激。
圖1 “閃光冷凍”示意圖
今天為大家介紹一種新穎的、可用于完整的哺乳動物急性腦切片和器官切片培養(yǎng)的快速和冷凍方法，該方法探索了小鼠海馬齒狀回顆粒細胞（gyrus granule cell）與CA3錐體神經(jīng)元之間的海馬苔蘚纖維突觸（hippocampal mossy fiber synapse）的結構和功能，囊泡池的變化。
內(nèi)容摘要神經(jīng)科學的主要重點是進一步理解突觸的結構和功能，以及兩者之間的關系。盡管對突觸傳遞的認知有了重要進展，但仍有許多問題沒有得到解答。由于中樞突觸的分子組成、結構和功能高度多樣化，因此對突觸進行分析對逾越這些知識鴻溝大有裨益。
電鏡提供了具有納米級別的空間分辨率，然而它有一個很明顯的缺點就是只能捕捉靜態(tài)圖像。為了分析活標本中的突觸，通常使用共聚焦、雙光子和超高分辨技術成像，然而這些技術經(jīng)常用于離體培養(yǎng)的神經(jīng)元，很難達到足夠的分辨率來識別單個的激活區(qū)或單個突觸囊泡。因此，想要洞悉中樞突觸的結構-功能關系，需要尋找一項兼顧捕捉納米級空間和毫秒級時間分辨率的技術。
與以往報道方法不同的是，這種改進的“閃光與冷凍”技術，可應用于急性切片和類器官切片培養(yǎng)。這些優(yōu)勢源于使用了薄的急性切片、改進后的載體幾何結構、恢復方案及低溫保護和冷凍技術。
基于這一依據(jù)，這一技術被應用于海馬齒狀回顆粒細胞（gyrus granule cell）與CA3錐體神經(jīng)元之間的海馬苔蘚纖維突觸（hippocampal mossy fiber synapse）。苔蘚纖維突觸具有大突觸末端，形態(tài)超微結構明顯，突觸囊泡數(shù)量多，囊泡直徑變化大，存在致密的核囊泡。從生理學角度看，該突觸初始釋放概率低、突觸可塑性高。
實驗方法選擇用于研究突觸前神經(jīng)元的轉基因小鼠，Prox1啟動子靶向這些樣本的齒狀回顆粒細胞。將pro1-creert2系與Ai32(ChR2(H134R)-EYFP)小鼠雜交，選擇性表達通道型視紫紅質(zhì)。借助免疫熒光和共聚焦顯微鏡觀測EYFP在顆粒細胞中的選擇性表達。急性切片制備與器官切片培養(yǎng)方式如前所述，使海馬苔蘚纖維保持好的狀態(tài)，以用于電生理學和高壓冷凍（HPF）實驗。
首先，對急性切片與器官切片培養(yǎng)中光刺激下的突觸傳導進行了深入的電生理學特征分析，以確定“閃光冷凍”實驗的參數(shù)，比如脈沖持續(xù)的時間和頻率。為了匹配
EM ICE高壓冷凍系統(tǒng)，需注意控制刺激的功率和強度。
圖2 優(yōu)化后的“閃光冷凍”技術工作流
接下來，借助
EM ICE系統(tǒng)進行高壓冷凍和光刺激，使用EM AFS或EM AFS2進行冷凍替代。用杜氏樹脂對切片和器官培養(yǎng)物進行包埋，然后用
EM UC7冷凍超薄切片機制成超薄切片。
最后用透射電鏡(TEM)觀察樣品。根據(jù)苔蘚纖維的特性和形態(tài)差異，在海馬CA3區(qū)發(fā)現(xiàn)了苔蘚纖維末端。重點分析對照組和實驗組中活動區(qū)的著位囊泡的數(shù)量和直徑，以及在半活動區(qū)的潛在內(nèi)吞凹陷形成。
實驗結果“閃光冷凍”電鏡的拍攝的HPF小鼠急性腦片海馬CA3區(qū)圖像如下：A)低倍鏡圖像顯示青苔狀纖維軸突(綠色箭頭)穿過透明層，CA3錐體神經(jīng)元樹突(藍色箭頭)穿過青苔狀纖維，少量青苔狀纖維(紅色箭頭)位于這些樹突和軸突之間。B)高倍鏡圖像顯示苔蘚纖維(紅色箭頭)布滿突觸囊泡和苔蘚纖維軸突(綠色箭頭)。優(yōu)化后的實驗體系保留了急性切片的超微結構，可媲美無光遺傳學刺激的HPF類器官腦片的超微結構。
圖3 HPF急性切片的EM圖像
結果顯示，“未釋放”囊泡池（the docked vesicle pool）和在和“已釋放”囊泡池（the functionally defined readily releasable pool）之間有重疊，即兩種囊泡具有共同的結構和功能部分，這為隨后突觸的快速內(nèi)吞作用提供了證據(jù)。
此外，作者展示了中度刺激后內(nèi)吞的孔狀結構外觀，提供了快速網(wǎng)格蛋白獨立的內(nèi)吞機制的結構證據(jù)。
圖4 結果示意圖
實驗結論這項研究表明了了“閃光冷凍”技術的廣泛適用性，可用于小鼠海馬組織的急性切片和器官切片培養(yǎng)，也可用于包括小腦和腦干在內(nèi)的多種大腦區(qū)域的急性切片。
總的來說，這一整體升級后的“EM”技術可用于急性大腦切片突觸傳遞過程中的多個時間節(jié)點的囊泡池變化（結構和功能）機制研究。
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References
- C. Borges-Merjane, O. Kim, P. Jonas, Functional Electron Microscopy, ‘‘Flash and Freeze,’’ of Identified Cortical Synapses in Acute Brain Slices, Neuron (2020) vol. 105, iss. 6, pp. 992–1006, DOI: 10.1016/j.neuron.2019.12.022.
- D. Vandael, C. Borges-Merjane, X. Zhang, P. Jonas, Short-term plasticity at hippocampal mossy fiber synapses is induced by natural activity patterns and associated with vesicle pool engram formation, Neuron (2020) vol. 107, iss. 3, pp. 509-521, DOI: 10.1016/j.neuron.2020.05.013.
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