產(chǎn)品簡介：

本產(chǎn)品是在根據(jù)細菌特點設(shè)計的細菌總 RNA 提取試劑盒。它基于異硫氰酸胍/酚/氯仿提取RNA 原理，可用于包括 E.coli、Campylobacter fetus、Pseudomonas aeruginosa、Rhodobacter sphaeroides 等各種常見的革氏陰性細菌。如果需要提革氏陽性細菌（如 Bacillus subtilis、Staphylococcus aureus 等）的RNA，可以選擇本公司的真菌 RNA 純化試劑盒。

產(chǎn)品特點：

1.操作簡單快速，只要十分鐘左右,可以全在室溫下進行。

2.所得 RNA 質(zhì)量高，OD260/OD280 一般在 1.9，基因 DNA 污染低。

3.靈敏度高，可以從一個菌落中提取到普通電泳能夠檢測到的總 RNA。

4.性價比高于進口同類產(chǎn)品。

5.本產(chǎn)品足夠 100 次微量提取。

6.細菌 RNA 純化試劑盒（沉淀法）只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

成分規(guī)格包裝

細菌 RNA 純化溶液100 mL100 mL 棕玻瓶

使用手冊1 份1 份

運輸及保存

常溫運輸，4℃保存，有效期一年。

自備試劑

氯仿，異丙醇，75%乙醇，RNA 溶解液。

使用方法：

1.在 1.5 mL 塑料離心管中離心收集 0.2-1.5 mL 新鮮細菌(注意:由于細菌 RNA 半衰期十分短，所以必須使用最-新鮮細菌)，吸盡液體培養(yǎng)基，加入 1 mL 細菌 RNA純化溶液并用槍充分吹打，確保細菌全部裂解并且沒有塊狀物。如果使用菌落，則用接種環(huán)小心將其轉(zhuǎn)移到裝有 1 mL 細菌 RNA 純化溶液的 1.5 m 塑料離心管中， 用移液槍吹打均勻。在細菌數(shù)較少時，建議使用核酸助沉劑以提高 RNA 回收率。

2.加入 0.2 mL 氯仿，在振蕩器上充分振蕩混均 30 秒（必須將管底的液體振蕩起來， 否則不能有效將 DNA 打斷和去除蛋白質(zhì)）。

3.14,000×g 室溫離心 3 分鐘。上清液無色，下層液呈籃色，中間為蛋白質(zhì)。小心將上清液轉(zhuǎn)移到另一干凈 1.5 mL 塑料離心管中，上清液體積約為 0.6 mL。為避免觸及中間層的 DNA 和蛋白質(zhì)，建議分小量多次吸取，并且只取 0.5 mL，留 0.1 mL 左右不取。當(dāng)細菌數(shù)量較少時，中間層將十分松散，上清時很容易吸到下層有機相， 需要更加小心。

4.在上清液中加入等體積的異丙醇，振蕩器上振蕩混均 30 秒。

5.14,000×g 室溫離心 3-10 分鐘，RNA 將在管底側(cè)面形成沉淀。

6.小心吸棄上清液，注意不要吸棄 RNA 沉淀。

7.在離心管中加入 1 mL 75%乙醇，振蕩器上振蕩混均 30 秒。

8.14,000×g 室溫離心 1 分鐘。

9.小心吸棄上清液，注意不要吸棄 RNA 沉淀。

10.短暫快速離心，用移液槍小心吸棄殘留液（約 50 μL）。

11.室溫開蓋短暫放 1-2 分鐘后加入適量 RNA-free 水使 RNA 沉淀溶解。所得 RNA 溶液可以立即使用或存放于-80℃長期保存。

12.RNA 完整性的電泳檢測：

如果需要做 Northern 雜交，強烈建議用戶使用甲醛變性膠進行 RNA 電泳，因為非變性膠不能分離所有的RNA 分子。如果是簡單檢測，可以使用 TAE 電泳液，但文獻報道必須使用變性上樣液。普通 DNA 上樣液不含變性劑，也沒經(jīng)過去 RNase 處理，所以最好不要使用。尤其需要注意的是不要使用 TBE 進行 RNA 電泳，因為TBE 所含硼酸是研究多糖的經(jīng)典方法 硼酸絡(luò)合法中的關(guān)鍵成分，硼酸通過與

RNA 核糖中的羥基發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，形成 RNA 分子內(nèi)或 RNA 分子間的絡(luò)合復(fù)合物， 使同樣長度的 RNA 具有不同的泳動速度，電泳條帶彌散，同時有大的 RNA 絡(luò)合復(fù)合物遲留在加樣孔中（一般會誤以為是基因組 DNA 污染）。RNA 分子內(nèi)或 RNA 分子間的絡(luò)合物的形成的多少和比例又與硼酸與 RNA 的數(shù)量比例有關(guān)，而 RNA 樣品中污染的其他多糖（如植物中提取的 RNA）也會參與此反應(yīng)，使硼酸對 RNA 電泳的影響更復(fù)雜，所以 TBE 對 RNA 電泳的影響沒有規(guī)律性和重復(fù)性。有的樣品可以使用有的又不行，最好是避免使用。

由于細菌細胞中 70-80%的 RNA 為 rRNA，后者又由 23S (約 3700 nt)，16S (約 1700 nt)和 5S (約 100 nt)三種組成，所以變性膠電泳后應(yīng)該 在UV 下看見三條清晰的 rRNA 帶。由于核酸長度與結(jié)合 EB 的數(shù)量成 正比（當(dāng)然還與 RNA 的二級結(jié)構(gòu)有關(guān)，雙鏈部分結(jié)合能力比單鏈部分強），所以 23S rRNA 條帶的熒光強度一般比 16S rRNA 條帶的熒光強度強 2 倍。如果這兩條 rRNA 帶不清晰或比例小于此范圍則表示 RNA 有降解（因為大的 RNA 被酶降解的可能更大）。

13.RNA 產(chǎn)量產(chǎn)率測定：

將 5-10 μLRNA 溶于 TE 緩沖液中(pH 7.5-8.2 之間)檢測其在 OD260 的光吸收。通過光吸收可以得出 RNA 濃度（1 OD260 的 RNA=40 μg/mL），進而計算出 RNA 的產(chǎn)量和產(chǎn)率。注意不要將 RNA 稀釋在 DEPC 水中檢測 OD260 和

OD280，否則光吸收比在TE 中測得的低 10%-15%，因為核酸光吸收跟溶液pH相關(guān)，而 DEPC 水中的 DEPC 高壓分解后產(chǎn)生的 CO2 與水反應(yīng)生成碳酸，使溶液pH 降低進而降低 RNA 的光吸收。

14. RNA 純度測定：

無污染的總RNA 的OD260/OD280 一般在 1.8-2.1 之間(具體數(shù)值與其堿基組成和溶液成分等多種因素有關(guān))，OD260/OD230 一般在 2.0-2.3 之間，如果低于或高于此范圍則分別表示樣品可能有蛋白質(zhì)或多糖的污染，但一般不影響RT-PCR 等反應(yīng)。蛋白質(zhì)污染可以通過酚/氯仿抽提一次然后酒精沉淀去除，DNA

和多糖污染可以分別用 DNA 清除劑和 PS 清除劑去除。

選擇我們的細菌 RNA 純化試劑盒（沉淀法），就是選擇精準(zhǔn)、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！