人原代肝細(xì)胞

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

該說(shuō)明書(shū)方法適用于本公司提取的人原代肝細(xì)胞，  您使用時(shí),  請(qǐng)按隨貨的說(shuō)明書(shū)操作，如有任何疑問(wèn)可咨詢(xún)公司技術(shù)人員。僅用于科研使用，不得用于臨床。

I 簡(jiǎn)介

我們的原代肝細(xì)胞分離自正規(guī)醫(yī)院獲取的人肝組 織， 所有材料來(lái)源清晰，病人或 者家屬知情同意。 我們的細(xì)胞產(chǎn)品經(jīng)過(guò)多種測(cè)試， 復(fù) 蘇后細(xì)胞活力高 、極化（分化）形態(tài)明顯， 可廣泛應(yīng) 用于基礎(chǔ)生命 科學(xué)研究以及藥物研發(fā)中。

II   試劑與材料

-人原代肝細(xì)胞

-復(fù)蘇培養(yǎng)基

-純化培養(yǎng)基（如需要，隨細(xì)胞贈(zèng)送）

-鋪板培養(yǎng)基

-維持培養(yǎng)基

-膠原包被培養(yǎng)板

-無(wú)菌 15ml 離心管

-寬口移液槍頭（普通移液槍頭剪去尖頭，再滅菌使用） -移液槍

-恒溫水浴鍋（37℃預(yù)熱， 請(qǐng)用溫度計(jì)校準(zhǔn)）

-冷凍水平離心機(jī)（帶水平轉(zhuǎn)子，可離心 15ml 離心管）

-生物安全柜

-37oC/5%CO2  培養(yǎng)箱

III 懸浮細(xì)胞的復(fù)蘇

1.      生物安全柜中， 將 10ml  復(fù)蘇培養(yǎng)基（Cat#LV- Rec003）加入到 15ml  離心管中， 37℃恒溫水浴鍋 預(yù)熱 20min，然后轉(zhuǎn)移到生物安全柜中； 鋪板培養(yǎng) 基 37℃預(yù)熱。

2.     將凍存的肝細(xì)胞從冷藏位置迅速轉(zhuǎn)移至 37℃恒溫 水浴鍋中，盡可能多的浸入 37℃水中，順時(shí)針?biāo)?搖動(dòng)， 但必須確保凍存管管蓋保持在水面以上。

3.     解凍凍存管約 90 ~ 120s ，至凍存管中只有小塊碎冰 漂浮即可。

4.    用 75%酒精消毒凍存管， 并將其轉(zhuǎn)移到生物安全柜。

5.     用寬口槍頭將細(xì)胞吸出，并以滴加方式轉(zhuǎn)移至含已 預(yù)熱的復(fù)蘇培養(yǎng)基的離心管中（注意：  凍存管與槍

頭上殘留細(xì)胞，可吸取 1ml復(fù)蘇培養(yǎng)基清洗凍存管

與槍頭并將其混入離心管的培養(yǎng)基中），輕微上下 顛倒離心管 2-3 次混勻。

6.     可直接低速離心（離心對(duì)細(xì)胞活力有一定的影響）， 50×g，常溫離心 5min 。去上清，用藥物代謝專(zhuān)用培 養(yǎng)基（LV-WEM011 或者客戶(hù)自備） 重懸，用臺(tái)盼 藍(lán)排除法（血球計(jì)數(shù)板手工計(jì)數(shù)，  勿用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀） 測(cè)定肝細(xì)胞的活力、活細(xì)胞數(shù)。按照實(shí)驗(yàn)要求加入  藥物， 測(cè)定藥物代謝情況。

IV 貼壁細(xì)胞的復(fù)蘇

1.   生物安全柜中，將 10ml 復(fù)蘇培養(yǎng)基（Cat#LV-Rec001） 加入到 15ml 離心管中，37℃恒溫水浴鍋預(yù)熱20min ， 然后轉(zhuǎn)移到生物安全柜中；鋪板培養(yǎng)基 37℃預(yù)熱。

2.    將凍存的肝細(xì)胞從冷藏位置迅速轉(zhuǎn)移至37℃恒溫水 浴鍋中。盡可能多的浸入 37℃水中， 順時(shí)針旋轉(zhuǎn)解 凍，但必須確保凍存管管蓋保持在水面以上。

3.   解凍凍存管約 90-120S，至凍存管中只有小塊碎冰漂 浮即可。

4.    用 75%酒精消毒凍存管，并將其轉(zhuǎn)移到生物安全柜。

5.    用寬口槍頭將細(xì)胞吸出，并以滴加方式轉(zhuǎn)移至含有 10ml 預(yù)熱的復(fù)蘇培養(yǎng)基的 15ml  離心管中（注意：

凍存管與槍頭上殘留細(xì)胞，   可吸取 1ml復(fù)蘇培養(yǎng)基

清洗凍存管與槍頭并將其混入離心管的培養(yǎng)基中）， 輕微上下顛倒 2-3 次混勻。

6.    用臺(tái)盼藍(lán)排除法（血球計(jì)數(shù)板手工計(jì)數(shù)，勿用細(xì)胞 計(jì)數(shù)儀）測(cè)定肝細(xì)胞的存活率和細(xì)胞總量， 建議檢 測(cè) 3 次，求取平均值。

7.   步驟 6 所得細(xì)胞得到的細(xì)胞， 嚴(yán)格按照具體實(shí)驗(yàn)用

途選擇合適的處理方式。

7. 1 細(xì)胞懸液可直接鋪板（細(xì)胞得率最大）

按照 1.8~2.0×105cells/cm2 接種到膠原包被培養(yǎng)板中， 搖勻， 置 37oC/5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng) 2 小  時(shí)，細(xì)胞處于半貼壁狀態(tài)，輕輕去掉培養(yǎng)基和未貼  壁細(xì)胞，輕輕沿著壁加入鋪板培養(yǎng)基， 繼續(xù)培養(yǎng) 24   小時(shí)。

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7.2  細(xì)胞懸液低速離心再鋪板（細(xì)胞狀態(tài)更好）

50×g，常溫離心 5min。去上清，用鋪板培養(yǎng)基重懸，

用臺(tái)盼藍(lán)排除法（血球計(jì)數(shù)板手工計(jì)數(shù)，勿用細(xì)胞

計(jì)數(shù)儀）測(cè)定肝細(xì)胞的活力、活細(xì)胞數(shù)。

按照 1.8~2.0×105cells/cm2 接種到膠原包被培養(yǎng)板中，

搖勻，置 37oC/5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng) 24 小時(shí)。

V 肝細(xì)胞維持及乙型肝炎病毒感染

1.    貼壁培養(yǎng) 24 小時(shí)，細(xì)胞已經(jīng)貼壁，移除鋪板培

養(yǎng)基（含部分死細(xì)胞），加入維持培養(yǎng)基， 每 2 天換

液 1 次。

2.   制 備 感 染 培 養(yǎng) 液 ： 維 持 培 養(yǎng) 基 中 預(yù) 先 加 入

4%PEG8000   并 混 勻 ， HBV   病 毒 （HepAD38

MOI=500~ 1000,  純化病人血清 MOI= 100~500 ，更

高的 MOI 可能進(jìn)一步提高感染效率）。

3.   移除舊培養(yǎng)液， 加入感染培養(yǎng)液， 在 37℃/5% CO2

培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 16h 或過(guò)夜。

4.   移除感染培養(yǎng)液，PBS 清洗 3 次，加入維持培養(yǎng)基，

在 37℃/5%CO2 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

5.   HBV  感染后每 2  天收上清 1  次， 用于病毒抗原及

HBV DNA 檢測(cè)，收集 3dpi、5dpi、7dpi、9dpi 上清，

9dpi  可結(jié)束細(xì)胞培養(yǎng)，更長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間取決于細(xì)胞

狀態(tài) (dpi:  感染后培養(yǎng)天數(shù))。

VI 關(guān)于售后

如您發(fā)現(xiàn)有產(chǎn)品任何質(zhì)量問(wèn)題，請(qǐng)您收集原始數(shù)據(jù)，

請(qǐng)第一時(shí)間聯(lián)系公司銷(xiāo)售或者技術(shù)支持，公司安排人員

保證售后。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室條件不同， 操作人員習(xí)慣不同，

熟練程度不一樣，實(shí)驗(yàn)失敗存在客觀因素。如未嚴(yán)格按

照說(shuō)明書(shū)操作、超過(guò)售后時(shí)限， 公司不做售后， 請(qǐng)老師理解與支持。

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