貨號： HG-CL200

產(chǎn)品簡介：

本試劑盒用于生物制品樣本前處理，精準抽提各種生物制品中宿主細胞殘留DNA。本試劑盒適用于多種基質(zhì)緩沖溶液，有效 提取純化微量的DNA。可與譜新支原體DNA檢測試劑盒配合使用。

規(guī)格：

100人份

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品儲存條件與有限期：

規(guī)定儲存條件下12個月。

試驗所需自備器材和試劑

無水乙醇（分析純）、1×PBS緩沖液（無Mg2+和Ca2+，除菌過濾，pH7.4）、異丙醇（分析純）、5M NaCl、1M NaOH、 1M HCl；

渦旋儀、磁力架、迷你離心機、高速離心機、水浴鍋/金屬浴、移液器；

1.5mL無菌低吸附離心管、低吸附吸頭、一次性手套。

試驗所需自備器材和試劑

試驗準備

1、每次試驗需要在干凈的試劑瓶中用無水乙醇和滅菌的超純水配制成新鮮的80%乙醇。 

2、單個樣本的工作結(jié)合液的準備：200µL結(jié)合液+9µL糖原+0.2µL酵母tRNA（如果提取酵母DNA，結(jié)合液中不加酵母 tRNA）。   

3、洗滌液準備：洗滌液使用前加30mL的無水乙醇，充分混勻后使用，同時做好標記，每次使用后將瓶蓋蓋緊，以保持瓶中 的無水乙醇含量。 

4、5M NaCl 準備：稱取1.4625g NaCl，加入5mL滅菌過的超純水搖勻，建議分裝保存。 

5、水浴鍋/金屬浴準備：65℃和70℃兩個溫度。

樣本準備

1、樣本稀釋：如果待檢測樣本是生物制品純化過程中的上游中間樣本，可能含有較高的DNA含量。為了保證檢測的準確性， 使樣本的檢測值在標準曲線線性范圍之內(nèi)，可以用1×PBS緩沖液對高DNA含量樣本進行適當比例稀釋后再進行樣本提取，一般 可考慮將高DNA含量樣本稀釋100倍或1000倍。 

2、干粉樣本： 一般可考慮將干粉樣本稀釋成10mg/mL或100mg/mL，再進行提取操作。 

3、pH值要求：使用1M NaOH或1M HCl調(diào)整樣品的pH至中性（pH6.0~8.0）進行提取。 

4、平行處理：每個樣本建議進行三次DNA提取處理。 

5、樣品加標：待處理樣品的DNA加標濃度為樣品核酸濃度的2-10倍為宜，建議樣品加標體積不超過待處理樣本體積的 1/10。 

6、陰性對照：每次試驗需用無模板稀釋液（1×PBS緩沖液或DNA稀釋液）與待測樣本一同處理。

操作流程

1、每個待處理樣本取100µL于1.5mL離心管中，待進一步提取。 

2、每個100µL樣本中加入10μL 5M NaCl、100μL裂解液和10μL蛋白酶K，渦旋震蕩30s，瞬時離心，65℃孵1h。 

注：單個樣本所需蛋白酶K及裂解液的用量需根據(jù)樣本蛋白濃度進行調(diào)整，具體如下表

接下來操作步驟分為手動提取和機器提取，用戶可根據(jù)需要選擇相應的提取方式進行操作。

手動提取

3、孵育完成后將離心管瞬時離心，之后依次加入209.2μL工作結(jié)合液、250μL異丙醇和20μL磁珠（磁珠使用前需充分混勻， 確保每次加入的磁珠量均一致，以免造成DNA得率不一致），渦旋振蕩10min，快速離心10s。

4、將離心管置于磁力架，輕輕地左右轉(zhuǎn)動，待磁珠聚集于貼近磁力架的管壁后，保持離心管固定于磁力架上，用移液槍吸去 上清，注意不要觸碰磁珠。

5、加入500μL洗滌液（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），渦旋振蕩30s，確保磁珠分散，離心管壁無聚集磁珠?？?速離心10s后將離心管重新置于磁力架上輕輕地左右轉(zhuǎn)動，待磁珠聚集于貼近磁力架的管壁后，靜置1min，用移液器小心吸去上清。 

6、加入500μL新鮮配制的80%乙醇，渦旋振蕩30s，確保磁珠分散，離心管壁無聚集磁珠?？焖匐x心10s后將離心管重新 置于磁力架上輕輕地左右轉(zhuǎn)動，待磁珠聚集于貼近磁力架的管壁后，靜置1min，用移液器小心吸去上清。 

7、為保證盡量吸出殘留乙醇，可將離心管快速離心10s后，置于磁力架上用10μL移液器吸出殘留乙醇。 

8、打開管蓋室溫干燥3-5min（干燥時間依具體情況進行延長或縮短；肉眼隨時注意觀察，避免磁珠過分干燥）。   注：干燥過程中磁珠過干或有乙醇殘留都會影響樣本回收率。干燥也可選擇鼓風干燥，一般建議鼓風干燥2min。 

9、將離心管從磁力架取下，每管加入100μL洗脫液，渦旋振蕩1min，70℃孵育7min，期間每2-3min渦旋混勻一次。 

10、孵育完成后，將離心管高速離心1min，然后靜置于磁力架上，待磁珠分離后，用移液器小心轉(zhuǎn)移上清到新的1.5mL離 心管中。

機器提取 （以下僅供參考，需結(jié)合核酸自動i提取儀的具體操作流程）

3、孵育完成后將離心管瞬時離心。按照下述 96 深孔板排布預先加入相應溶液，其中：

• 第3或9列：工作結(jié)合液209.2μL/孔、異丙醇250μL/孔、磁珠20μL/孔及經(jīng)消化后的樣本。 

• 第4或10列：洗滌液500μL/孔。 

• 第5或11列：80%乙醇500μL/孔。 

• 第6或12列：洗脫液100μL/孔。 

注：第3或9列可在其他列試劑全部加完后再加。

4、將儀器電源插頭插入220V交流電源，儀器開機后顯示初始界面，幾秒鐘后儀器進入自檢狀態(tài)。整個開機和自檢過程需 1~2 min。

5、根據(jù)需求進入三級管理系統(tǒng)的不同層級，點擊窗口上部的“運行”進入運行界面，點擊紫外燈按鈕開關進行紫外線消毒。

6、打開儀器前視窗門，拉出托盤至最外側(cè)，將加好樣的96孔深孔板放入儀器中固定位置，放置孔板時須注意其方向(A1位 置為左前位置），將托盤推入最內(nèi)側(cè)，把磁力套依次插入磁架T型槽內(nèi)，關閉儀器前視窗門。點擊窗口上部的“流程庫”選擇相 應的程序。點擊“編輯”，根據(jù)需要修改純化過程中的時間、溫度、溶液體積等參數(shù) 

7、程序確認無誤后，點擊窗口上部的“運行”進入運行界面，點擊“開始”按鈕，啟動流程開始運行，儀器會自動進行處理 直至完成。   注：運行前再次檢查磁力套是否插入磁架T型槽內(nèi)。 

8、運行完成后，拿出96孔深孔板及磁力套。從對應孔中取出純化完成的樣本洗脫液，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中。 注：若純化完成的樣本洗脫液中殘留磁珠，可將核酸純化液再次高速離心3min，將離心管靜置于磁力架上，放置2min，待 溶液澄清用移液器小心轉(zhuǎn)移上清至新1.5mL離心管中。 

9、點擊窗口上部的“運行”進入運行界面，點擊紫外燈按鈕開關進行紫外線消毒，注意關閉儀器前蓋。消毒結(jié)束后，關閉儀器。

注意事項：

1、實驗開始前，為減少污染建議用酒精擦拭臺面、移液器、槍頭盒等表面。
2、注意在不同加樣步驟間及時更換吸頭，避免交叉污染。建議使用帶濾芯的槍頭。
3、離心機：選擇升降速快的離心機，防止離心不充分導致實驗失?。ㄓ绕涫抢匣碾x心機，還有污染的可能性）。
4、所有試劑需平衡至室溫，再進行實驗。
5、首i次使用前，請按照試劑瓶上標簽，在洗滌液中加入指i定體積的無水乙醇，充分混勻后使用，同時做好標記，每次使用 后將瓶蓋蓋緊，以保持瓶中的無水乙醇含量。
6、在每一步操作時，用左手順時針方向環(huán)握EP管，大拇指輕輕打開管蓋，勿將液體濺出。
7、在磁性分離架上分離磁珠時，中途可以適當旋轉(zhuǎn)離心管，使磁珠吸附更加集中。
8、在磁珠洗滌或洗脫過程中，每次振蕩混勻后，都要短時間快速離心，以保證沒有磁珠液附著在離心管管蓋和管壁上。
9、盡量在當天完成樣本前處理純化就立即進行后續(xù)DNA檢測，以保證檢測結(jié)果的準確性。 

10、試劑應儲存于規(guī)定環(huán)境下，不同批次試劑盒試劑不建議混用。
11、最終的試驗結(jié)果與試劑的有效性、操作者的操作方法及實驗環(huán)境密切相關。

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